Большинство патогенных микроорганизмов выращивают

МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ И БИОХИМИЧЕСКИХ

СВОЙСТВ

Культивирование, то есть выращивание микроорганизмов в ла­боратории, применяется для изучения их свойств и для получения био­массы. Бактерии, грибы, актиномицеты, спирохеты и некоторые про­стейшие культивируются на питательных средах. Хламидии, риккетсии, вирусы и некоторые простейшие способны размножаться только в орга­низме животного или в живых клетках.

Культуральные свойства данного вида микроорганизмов — это: 1) условия, необходимые для размножения, и 2) характер роста на пита­тельных средах. Культуральные свойства — это одна из характеристик, которые учитываются при идентификации (определения вида) микро­организмов.

Питательные среды

Питательные среды должны соответствовать определенным тре­бованиям. Они должны содержать все питательные вещества, необхо­димые для размножения данного вида микробов. Одни патогенные мик­роорганизмы растут на простых питательных средах, другие для свое­го размножения нуждаются в добавлении крови, сыворотки крови, ви­таминов.

В питательных средах должны быть созданы определенные условия путем добавления хлорида натрия или буферных растворов. Для боль­шинства бактерий благоприятной является питательная среда, со­держащая 0,5% хлорида натрия. Реакция питательной среды, благоп­риятная для большей части патогенных бактерий — слабощелочная, что соответствует рН=7,2-7,4. Холерный вибрион растет при рН=7,8-8,5, гри­бы — при рН=5-5,5. Питательные среды должны быть влажными, то есть содержать достаточное количество воды, быть по возможности прозрач­ными и стерильными, то есть до посева не содержать микробов.

По составу и происхождению питательные среды бывают естест­венные, искусственные и синтетические. Естественные питательные среды — это натуральный продукт, например, картофель, другие ово­щи. Искусственные питательные среды готовят по определенной про­писи из продуктов с добавлением органических и неорганических со­единений. Синтетические среды содержат определенные химические соединения в известных концентрациях.

По консистенции питательные среды бывают жидкие, полужид­кие, плотные. В качестве уплотнителя обычно применяют агар-агар -полисахарид, выделенный из морских водорослей. Агар-агар не используется микроорганизмами в качестве питательного вещества, образует в воде гель, плавящийся при 100°С и застывающий при 45°С.

Для получения плотной питательной среды агар-агар добавляют в кон­центрации 1,5-2%, для полужидкой — 0,5%.

По целевому назначению питательные среды могут быть разде­лены на обычные (простые), специальные, элективные, дифференци­ально-диагностические.

Обычные (простые) питательные среды применяют для культиви­рования большинства микроорганизмов, это мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА).

Специальные питательные среды применяют для культивирования микроорганизмов, которые не растут на простых средах. Например, кровяной агар и сахарный бульон для стрептококка, сывороточный агар для менингококка и гонококка.

Элективные питательные среды используют для выделения одного какого-либо вида из смеси различных бактерий. Данный вид бактерий растет на этой среде быстрее и лучше других, опережая их в своем росте; рост других бактерий задерживается на этой среде. Например, свернутая сыворотка для палочки дифтерии, щелочная пептонная вода для холерного вибриона, желчный бульон для палочки брюшного тифа, солевые среды для стафилококка.

Дифференциально-диагностические питательные среды применя­ются для отличия одних видов бактерий от других по их фермента­тивной активности (см. соответствующий раздел).

Культивирование и выделение чистых культур аэробных бактерий

Для культивирования микроорганизмов необходимы определенные условия: температура, аэробные или анаэробные условия.

Температура должна быть оптимальной для данного вида. Боль­шинство патогенных бактерий размножаются при 37°С. Однако для некоторых видов оптимальной является более низкая температура, что связано с особенностями их экологии. Так, для палочки чумы, ес­тественным местом обитания которой являются грызуны в период зимней спячки, оптимум температуры составляет 28°С, как и для лептоспир, для палочки ботулизма — 28°С-35°С.

Кроме оптимальной температуры, для культивирования микроор­ганизмов, в зависимости от вида, необходима аэробность или анаэ-робность среды.

Для того, чтобы изучить морфологию, Культуральные, биохими­ческие и другие свойства микробов, необходимо получить чистую куль­туру. Обычно культурой микробов называют скопление их на пи­тательной среде в виде помутнения, придонного (пристеночного) рос­та или пленки на поверхности жидкой среды или колоний на плотной среде. Отдельная колония образуется из одной микробной клетки. Чи­стая культура — это культура микробов одного вида, полученная из од­ной колонии. В лабораториях для различных исследований применя­ют определенные известные штаммы микробов. Штамм — это чистая культура микробов, полученная из определенного источника, в опре­деленное время, обладающая известными свойствами. Как правило, штаммы микробов обозначают определенным номером. Например, штамм Staphylococcus aureus 209P применяется для определения актив­ности пенициллина.

Выделение чистых культур аэробов занимает, как правило, три дня и производится по следующей схеме:

1-й день — микроскопия мазка из исследуемого материала, ок­рашенного (обычно по Граму) — для предварительного ознакомления с микрофлорой, что может быть полезным в выборе питательной среды для посева. Затем посев материала на поверхность застывшего пита­тельного агара для получения изолированных колоний. Рассев можно произвести по методу Дригальского на три чашки Петри с питательной средой. Каплю материала наносят на первую чашку и распределяют шпателем по всей чашке. Затем этим же шпателем распределяют остав­шуюся на нем культуру на второй чашке и таким же образом — на тре­тьей. Наибольшее количество колоний вырастет на первой чашке, наи­меньшее — на третьей. В зависимости от того, сколько было микробных клеток в исследуемом материале, на одной из чашек вырастут изоли­рованные колонии.

Такого же результата можно достигнуть, произведя рассев на од­ной чашке. Для этого делят чашку на четыре сектора. Исследуемый материал засевают бактериологической петлей штрихами на первом секторе, затем, прокалив и остудив петлю, распределяют посев из пер­вого сектора во второй и таким же образом последовательно в тре­тий и четвертый сектор. Из отдельных микробных клеток после су­точного инкубирования в термостате образуются изолированные колонии.

2-й день — изучение колоний, выросших на чашках, описание их. Колонии могут быть прозрачными, полупрозрачными или непроз­рачными, они имеют различные размеры, округлые правильные или неправильные очертания, выпуклую или плоскую форму, гладкую или шероховатую поверхность, ровные или волнистые, изрезанные края. Они могут быть бесцветными или иметь белый, золотистый, красный, желтый цвет. На основании изучения этих характеристик выросшие колонии разделяются на группы. Затем из исследуемой группы отби­рают изолированную колонию, готовят мазок для микроскопического исследования с целью проверки однородности микробов в колонии. Из этой же колонии производят посев в пробирку со скошенным пита­тельным агаром.

3-й день — проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре путем микроскопии мазка. При однородности исследуемых бак­терий выделение чистой культуры можно считать законченным.

Для идентификации выделенных бактерий изучаются культураль-ные признаки, то есть характер роста на жидких и плотных пита­тельных средах. Например, стрептококки на сахарном бульоне образуют придонный и пристеночный осадок, на кровяном агаре — мелкие, точечные колонии; холерный вибрион образует пленку на поверхности щелочной пептонной воды, а на щелочном агаре — прозрачные коло­нии; палочка чумы на питательном агаре образует колонии в виде «кру­жевных платочков» с плотным центром и тонкими волнистыми края­ми, а в жидкой питательной среде — пленку на поверхности, а затем -нити, отходящие от нее в виде «сталактитов».

Культивирование и выделение чистых культур анаэробных бактерий

Для культивирования анаэробов необходимо понизить окисли­тельно-восстановительный потенциал среды, создать анаэробиоз пу­тем удаления кислорода физическими, химическими или биологичес­кими методами.

К физическим методам можно отнести:

1) механическое удаление воздуха с помощью насоса из анаэ-ростата, в котором помещают чашки с посевами. Одновременно мож­но заменить воздух индифферентным газом: азотом, водородом, угле­кислым газом.

2) выращивание в среде, содержащей редуцирующие вещества. Сре­да Китта-Тароцци — это сахарный бульон с кусочками печени или мяса. Глюкоза и кусочки органов обладают редуцирующей способностью. Среду заливают сверху слоем вазелинового масла, чтобы преградить доступ кислорода воздуха.

3) Наиболее простой, но менее надежный способ — выращивание в глубине высокого столбика сахарного агара.

Химические методы заключаются в том, что чашки с посевами ана­эробов ставят в герметически закрытый эксикатор, куда помещают хи­мические вещества, например, пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода.

Биологический метод основан на одновременном выращивании анаэробов и аэробов на плотных питательных средах в чашках Пет­ри, герметически закрытых после посева. Вначале кислород погло­щается растущими аэробами, а затем начинается рост анаэробов.

Выделение чистой культуры анаэробов начинают с накопления анаэробных бактерий путем посева на среду Китта-Тароцци. В даль­нейшем получают изолированные колонии одним из двух способов:

1) посев материала производят путем смешивания с расплавленным теплым сахарным агаром в стеклянных трубках. После застывания ага­ра в глубине его вырастают изолированные колонии, которые извле­кают путем распила трубки и пересевают на среду Китта-Тароцци (спо­соб Вейнберга);

2) посев материала производят на чашки с питательной средой и инкубируют в анаэростате. Выросшие на чашке изолированные ко­лонии пересевают на среду Китта-Тароцци (способ Цейсслера).

Культивирование других микроорганизмов

Культивирование микоплазм

Микоплазмы культивируются на питательных средах с добавле­нием сыворотки и углеводов. Поскольку микоплазмы лишены клеточ­ной стенки, они растут только в изотонических или гипертонических средах. На плотных питательных средах в течение нескольких суток образуются очень мелкие колонии, напоминающие яичницу-глазунью — с выпуклым центром и плоской полупрозрачной периферией. Микоп­лазмы можно выращивать также на курином эмбрионе или культуре клеток.

Культивирование риккетсий и хламидий

Риккетсии и хламидий — облигатные внутриклеточные паразиты. Для их культивирования используют культуры клеток, куриный эмбри­он и заражение животных.

Культивирование грибов

Для культивирования грибов применяют плотные и жидкие пита­тельные среды: чаще всего среду Сабуро, а также среды, содержащие пивное сусло. Грибы растут медленнее, чем бактерии, они образуют видимый рост в течение нескольких суток. Температура культивиро­вания ниже, чем у бактерий — 22-30°С.

Культивирование спирохет и простейших

Среди спирохет наиболее легко выращивать лептоспиры, пита­тельной средой для которых может служить вода с примесью сыво­ротки крови кролика. Боррелии и трепонемы культивируют в анаэ­робных условиях на более сложных питательных средах, содержащих сыворотку, кусочки тканей животных.

Среди простейших культивируются на питательных средах ди­зентерийная амеба, лямблии, трихомонады, лейшмании, трипаносомы, балантидии.Токсоплазмы культивируют в куриных эмбрионах и куль­турах тканей. Методы культивирования малярийных плазмодиев разрабатываются.

Методы изучения ферментативной активности (биохимических свойств)

В микробиологической практике изучение ферментативной ак­тивности используют для идентификации микроорганизмов, посколь­ку каждый микробный вид обладает определенным набором фермен­тов.

Для определения протеолитической активности микробы засева­ют уколом в столбик желатина и после 3-5 суток инкубирования при комнатной температуре отмечают характер разжижения желатина: в виде воронки, гвоздя, чулка или в виде опрокинутой елки. Протеолитическую активность определяют также по образованию продуктов разложения белка: индола, сероводорода, аммиака. Для их определения засевают микроорганизмы в мясо-пептонный бульон, и между горлыш­ком пробирки и ватной пробкой помещают индикаторные бумажки, исключая их контакт со средой. При образовании индола бумага, про­питанная насыщенным раствором щавелевой кислоты, приобретает розовый цвет; в присутствии сероводорода бумага, пропитанная аце­татом свинца, чернеет; при образовании аммиака красная лакмусо­вая бумажка синеет.

Для определения сахаролитических свойств микробов применяют дифференциально-диагностические среды такие, как среды Гисса, среда Олькеницкого, среда Эндо, среда Левина, среда Плоскирева.

Среды Эндо, Левина, Плоскирева в чашках Петри применяются для дифференцировки бактерий кишечной группы по их способности сбраживать лактозу. Эти среды содержат питательный агар, лактозу и индикатор, изменяющий свой цвет в кислой среде — индикатор рН. Если посеять на такую среду бактерии, которые сбраживают лактозу, на­пример кишечную палочку, то в результате сбраживания лактозы об­разуется кислота, и индикатор изменит свой цвет в кислой среде. По­этому колонии кишечной палочки на таких средах будут окрашенны­ми соответственно цвету индикатора: на среде Эндо и среде Плоски­рева — в красный цвет, на среде Левина — в черно-синий. Колонии бак­терий, не сбраживающих лактозу, таких как сальмонеллы и палочки дизентерии, будут бесцветными.

Среды Гисса (среды «пестрого ряда») готовятся на основе пептон-ной воды или полужидкого мясо-пептонного агара. Содержат какой-либо один углевод или многоатомный спирт и индикатор. При росте на среде Гисса микроба, сбраживающего данный субстрат с образо­ванием кислоты и газа, среда изменит цвет, в полужидкой среде по­явятся пузырьки и разрывы в толще агара, в жидкой среде — пузырек газа в стеклянном поплавке. При сбраживании субстрата только до кислоты происходит лишь изменение цвета среды.

Применяются также комбинированные среды, содержащие не один углевод, а два или три, например, среда Олькеницкого. Одна пробирка этой среды заменяет скошенный агар и среды Гисса с лактозой, глю­козой и сахарозой. После стерилизации в расплавленном виде среду в пробирке скашивают так, чтобы получился столбик и скошенная часть. Посев производится штрихом по скошенной части и уколом в столбик. При сбраживании лактозы или сахарозы изменяется цвет всей среды, при сбраживании одной глюкозы изменяется цвет только столбика. Образование газа определяется по наличию пузырьков в столбике ага­ра. При выделении микробами аммиака цвет среды не меняется. Образование сероводорода проявляется почернением в столоике агара

Для экспресс-метода определения ферментативной активности бак­терий применяются микротестсистемы и система индикаторная бумаж­ная (СИБ)

Микротестсистема представляет собой контейнер из прозрачного полистирола, состоящий из нескольких ячеек Ячейки содержат высу­шенные питательные среды с углеводами и индикаторами рН В каж­дую ячейку засевают взвесь культуры бактерий определенной густо­ты В контрольные ячейки наливают физ раствор Результат учитыва­ют после 3 — 4-хчасовой инкубации в термостате по изменению цвета

индикатора

Системы индикаторные бумажные (СИБ) для идентификации се­мейства энтеробактерий представляет собой диски или полоски хроматографической бумаги, покрытые защитной пленкой и содержащие определенный субстрат и индикатор В пробирки с физиологическим или буферным раствором вносят исследуемую культуру, затем поме­щают диски В контрольные пробирки культуру бактерий не вносят Результат учитывают по изменению цвета индикатора Для определе­ния сероводорода диск помещают на поверхность МПА, засеянного уколом, что позволяет одновременно определить подвижность

Во всех пробирках учитывают предварительный результат в тот же день и окончательный — на следующий день

Оксидазная активность определяется путем растирания культуры на индикаторной бумажке Результат учитывается через минуту.

Микроорганизмы (за исключением облигатных внутриклеточных паразитов— риккетсий, хламидий, вирусов и простейших) культивируют, как правило, на искусственных питательных средах. В зависимости от пищевых потребностей того или другого вида питательные среды должны содержать соответствующие исходные вещества, необходимые для пластического и энергетического метаболизма.

Выделение микроорганизмов из различных материалов и получение их культур широко используется в лабораторной практике для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний, в научно-исследовательской работе и в микробиологическом производстве вакцин, антибиотиков и других биологически активных продуктов микробной жизнедеятельности.

Условия культивирования также зависят от свойств соответствующих микроорганизмов. Большинство патогенных микробов выращивают на питательных средах при температуре 37°С в течение 12 сут. Однако некоторые из них нуждаются в более длительных сроках. Например, бактерии коклюша— в 2-3 сутках, а микобактерии туберкулеза — в 3—4 неделях.

Для стимуляции процессов роста и размножения аэробных микробов, а также сокращения сроков их выращивания используют метод глубинного культивирования, который заключается в непрерывном аэрировании и перемешивании питательной среды. Глубинный метод нашел широкое применение в биотехнологии.

Для культивирования анаэробов применяют особые методы, сущность которых заключается в удалении воздуха или замены его инертными газами в герметизированных термостатах — анаэростатах. Анаэробов выращивают на питательных средах, содержащих редуцирующие вещества (глюкозу, муравьинокислый натрий и др.), уменьшающие окислительно-восстановительные потенциал.

В диагностической практике особое значение имеют чистые культуры бактерий, которые выделяются из исследуемого материала, взятого у больного или объектов окружающей среды. С этой целью используют искусственные питательные среды, которые подразделяют на основные, дифференциально-диагностические и элективные самого разнообразного состава. Выбор питательной среды для выделения чистой культуры имеет существенное значение при бактериологической диагностике.

В большинстве случаев используют твердые питательные среды, предварительно разлитые в чашки Петри. На поверхность среды петлей помещают исследуемый материал и растирают шпателем, чтобы получить изолированные колонии, выросшие из одной клетки. Пересев изолированной колонии на скошенную агаровую среду в пробирку приводит к получению чистой культуры.

Для идентификации, т.е. определения родовой и видовой принадлежности выделенной культуры, чаще всего изучают фенотипические признаки:

а) морфологию бактериальных клеток в окрашенных мазках, либо нативных препаратах;

б) биохимические признаки культуры по ее способности ферментировать углеводы (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза, маннит и др.), образовывать индол, аммиак и сероводород, являющиеся продуктами протеолитической активности бактерий.

Для более полного анализа применяют газово-жидкостную хромографию и другие методы.

Наряду с бактериологическими методами для идентификации чистых культур широко используют иммунологические методы исследования, которые направлены на изучение антигенной структуры выделенной культуры. С этой целью используют серологические реакции: агглютанации, преципитации иммунофлюоресценции, связывания комплемента, иммуноферментный, радиоиммунный методы и др.

  1. Методы выделения чистой культуры

Для того, чтобы выделить чистую культуру микроорганизмов, следует отделить многочисленные бактерии, которые находятся в материале, одна от другой. Это можно достичь с помощью методов, которые основаны на двух принципах – механическом и биологическом разобщении бактерий.

Методы выделения чистых культур, основанные на механическом принципе

Метод последовательных разведений, предложен Л. Пастером, был одним из самых первых, который применялся для механического разъединения микроорганизмов. Он заключается в проведении последовательных серийных разведений материала, который содержит микробов, в стерильной жидкой питательной среде. Этот прием достаточно кропотлив и несовершенный в работе, поскольку не позволяет контролировать количество микробных клеток, которые попадают в пробирки при разведениях.

Этого недостатка не имеет метод Коха (метод пластинчатых разведений). Р.  Кох использовал плотные питательные среды на основе желатина или агар-агара. Материал с ассоциациями разных видов бактерий разводился в нескольких пробирках с растопленным и немного охлажденным желатином, содержание которого позже выливалось на стерильные стеклянные пластины. После застудневания среды оно культивировалось при оптимальной температуре. В его толще образовывались изолированные колонии микроорганизмов, которые легко могут быть перенесены на свежую питательную среду с помощью платиновой петли для получения чистой культуры бактерий.

Метод Дригальского является более совершенным методом, который широко распространен в повседневной микробиологической практике. Сначала на поверхность среды в чашке Петри пипеткой или петлей наносят исследуемый материал. С помощью металлического или стеклянного шпателя его тщательным образом втирают в среду. Чашку во время посева держат открытой и осторожно вращают, чтобы равномерно распределить материал. Не стерилизуя шпателя, проводят им занял материалу в другой чашке Петри, при потребности – в третьей. Только после этого шпатель окунают в дезинфицирующий раствор или прожаривают в пламени горелки. На поверхности среды в первой чашке наблюдаем, как правило, сплошной рост бактерий, во второй – густой рост, а в третьей – рост в виде изолированных колоний.

Колонии по методу Дригальского

Метод штриховых посевов сегодня используется в микробиологических лабораториях чаще всего. Материал, который содержит микроорганизмы, набирают бактериологической петлей и наносят на поверхность питательной среды возле края чашки. Снимают избыток материала и проводят занял его параллельными штрихами от края к краю чашки. Спустя сутки инкубации посевов при оптимальной температуре на поверхности чашки вырастают изолированные колонии микробов.

Метод штрихов

Для получения изолированных колоний можно использовать занял тампоном, которым проводили забор исследуемого материала. Несколько преоткрывают чашку Петри с питательной средой, вносят туда тампон и осторожными движениями втирают материал в поверхность чашки, возвращая постепенно тампон и чашку.

Таким образом, существенное преимущество методов пластинчатых разведений Коха, Дригальского и штриховых посевов заключается в том, что они создают изолированные колонии микроорганизмов, которые при инокуляции на другую питательную среду превращаются в чистую культуру

Методы выделения чистых культур, основанные на биологическом принципе

Биологический принцип разъединения бактерий предусматривает целеустремленный поиск методов, которые учитывают многочисленные особенности микробных клеток. Среди самых распространенных методов можно выделить следующие:

1. По типу дыхания. Все микроорганизмы по типу дыхания разделяются на две основных группы: аэробные (Corynebacterium diphtheriaeVibrio сholerae и тому подобное) и анаэробные (Clostridium tetaniClostridium botulinumClostridium perfringens и др.). Если материал, из которого следует выделить анаэробные возбудители, предварительно прогреть, а затем культивировать в анаэробных условиях, то вырастут именно эти бактерии.

2. По спорообразованию. Известно, что некоторые микробы (бациллы и клостридии) способны к споротворення. Среди них Clostridium tetaniClostridium botulinumClostridium perfringensBacillus subtilisBacillus cereus. Споры стойкие к действию факторов внешней среды. Следовательно, исследуемый материал может быть подданный действию термического фактора, а затем инокулятивно перенесен в питательную среду. Спустя некоторое время на нем вырастут именно те бактерии, которые способны к споротворению.

3. Стойкость микробов к действию кислот и щелочей. Некоторые микробы (Mycobacterium tuberculosisMycobacterium bovis) в результате особенностей их химического строения стойки к действию кислот. Вот почему материал, который их содержит, например, мокрота при туберкулезе предварительно обрабатывают равным объемом 10 % раствора серной кислоты, а затем высевают на питательные среды. Посторонняя флора погибает, а микобактерии в результате их резистентности к кислотам, вырастают.

Холерный вибрион (Vibrio сholerae), напротив, является галофильной бактерией, потому для создания оптимальных условий роста его высевают на среды, которые содержат щелочь (1 % щелочная пептонная вода). Уже через 4-6 часов на поверхности среды появляются характерные признаки роста в виде нежной голубоватой пленки.

4. Подвижность бактерий. Некоторые микробы (Proteus vulgaris) имеют тенденцию к ползучему росту и способны быстро распространяться по поверхности кое-что влажной среды. Для выделения таких возбудителей их засевают в капельку конденсационной жидкости, которая образуется при охлаждении столбика скошенного агара. Через 16-18 год они распространяются на всю поверхность среды. Если взять материал из верхней части агара, будем иметь чистую культуру возбудителей.

5. Чувствительность микробов к действию химических веществ, антибиотиков и других противомикробных средств. В результате особенностей метаболизма бактерий они могут иметь разную чувствительность к некоторым химическим факторам. Известно, что стафилококки, аэробные бациллы, которые образуют споры, стойкие к действию 7,5–10 % хлорида натрия. Вот почему для выделения этих возбудителей используют элективные питательные среды (желточно-солевой агар, манит-солевой агар), которые содержат именно это вещество. Другие бактерии при такой концентрации хлорида натрия практически не растут.

6. Введение некоторых антибиотиков (нистатин) используется для торможения роста грибов в материале, который сильно контаминированный ими. И, напротив, добавление антибиотика пеницилина к среде способствует  росту бактериальной флоры, если нужно выделить грибы. Добавление фуразолидона в определенных концентрациях к питательной среде создает селективные условия для роста коринебактерий и микрококков.

7. Способность микроорганизмов проникать через неповрежденные кожные покровы. Некоторые патогенные бактерии (Yersinia pestis) в результате наличия большого количества ферментов агрессии способны проникать через неповрежденную кожу. Для этого шерсть на теле лабораторного животного бреют и в этот участок втирают исследуемый материал, который содержит возбудителя и большое количество сторонней микрофлоры. Через некоторое время животное забивают, а из крови или внутренних органов выделяют микробов.

8. Чувствительность лабораторных животных к возбудителям инфекционных заболеваний. Отдельные животные проявляют высокую чувствительность к разным микроорганизмам.

Например, при любом способе введения Streptococcus pneumoniae белым мышам у них развивается генерализованная пневмококковая инфекция. Аналогичная картина наблюдается при заражении гвинейских свинок возбудителями туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis).

В повседневной практике бактериологи пользуются такими понятиями как штамм и чистая культура микроорганизмов. Под штаммом понимают микробов одного вида, которые выделены из разных источников, или из одного и того же источника, но в разное время. Чистая культура бактерий – это микроорганизмы одного вида, потомки одной микробной клетки, которые выросли на (в) питательной среде.

Выделение чистой культуры аеробних микроорганизмов состоит из ряда этапов.

В первый день (1 этап исследования) в стерильную посуду (пробирка, колба, флакон) забирают патологический материал. Его изучают — внешний вид, консистенция, цвет, запах и другие признаки, готовят мазок, красят и исследуют под микроскопом. В некоторых случаях (острая гонорея, чума) на этом этапе можно поставить предварительный диагноз, а кроме того, подобрать среды, на которые будет засеваться материал. Затем проводят бактериологической петлей (применяется чаще всего), с помощью шпателя — методом Дригальского, ватно-марлевым тампоном. Чашки закрывают, переворачивают вверх дном, подписывают специальным карандашом и ставят в термостат при оптимальной температуре (37 °С) на 18-48 часов. Цель этапа – получить изолированные колонии микроорганизмов.

Однако, порой с целью нагромождения материала его засевают на жидкие питательные среды.

На второй день (2 этап исследования) на поверхности плотной питательной среды микроорганизмы образуют сплошной, густой рост или изолированные колонии. Колония – это видимые невооруженным глазом скопления бактерий на поверхности или в толще питательной среды. Как правило, каждая колония формируется из потомков одной микробной клетки (клоны), потому их состав достаточно однороден. Особенности роста бактерий на питательных средах являются проявлением их культуральных свойств.

Чашки тщательным образом рассматривают и изучают изолированные колонии, которые выросли на поверхности агара. Обращают внимание на величину, форму, цвет, характер краев и поверхности колоний, их консистенцию и другие признаки. Если требуется, исследуют колонии под лупой, малым или большим увеличением микроскопа. Структуру колоний исследуют в проходном свете при малом увеличении микроскопа. Они могут быть гиалиновые, зернистые, нитевидные или волокнистые, которые характеризуются наличием переплетенных нитей в толще колоний.

Характеристика колоний – важна составная часть работы бактериолога и лаборанта, ведь микроорганизмам каждого вида присущи свои особенные колонии.

На третий день (3 этап исследования) изучают характер роста чистой культуры микроорганизмов и проводят ее идентификацию.

Сначала обращают внимание на особенности роста микроорганизмов на среде и делают мазок, крася его методом Грама, с целью проверки культуры на чистоту. Если под микроскопом наблюдают бактерии однотипной морфологии, размером и тинкториальных (способность краситься) свойств, делают вывод, что культура чиста. В некоторых случаях уже по внешнему виду и особенностям их роста можно сделать вывод о виде выделенных возбудителей. Определение вида бактерий по их морфологическим признакам называется морфологической идентификацией. Определения вида возбудителей по их культуральным признакам называют культуральной идентификацией.

Однако этих исследований недостаточно, чтобы сделать окончательный вывод о виде выделенных микробов. Потому изучают биохимические свойства бактерий. Они достаточно разнообразны.

  1. Идентификация бактерий.

Определение вида возбудителя по его биохимическим свойствам называется биохимической идентификацией.

С целью установления видовой принадлежности бактерий часто изучают их антигенное строение, то есть проводят идентификацию по антигенным свойствам. Каждый микроорганизм имеет в своем составе разные антигенные субстанции. В частности, представители семьи энтеробактерий (ешерихии, сальмонели, шигелы) содержат оболочковый О-антиген, жгутиковий Н-антиген и капсульный К-антиген. Они неоднородны своим химическим составом, потому существуют во многих вариантах. Их можно определить с помощью специфических аглютинуючих сывороток. Такое определение вида бактерий носит название серологической идентификации.

Иногда идентификацию бактерий проводят, заражая лабораторных животных чистой культурой и наблюдая за теми изменениями, которые вызывают возбудители в организме (туберкулез, ботулизм, столбняк, сальмонеллез и тому подобное). Такой метод называют идентификацией по биологическими свойствам. Как объекты – чаще всего используют гвинейских свинок, белых мышей и крыс.

ПРИЛОЖЕНИЯ

( таблицы и схемы)

Физиология бактерий

Схема 1. Физиология бактерий.

питание

дыхание

рост

размножение

выращивание на питательных средах

Таблица 1. Общая таблица физиологии бактерий.

Понятие

Характеристика

Питание

Процесс приобретения энергии и веществ.

Дыхание

Совокупность биохимических процессов, в результате которых освобождается энергия, необходимая для жизнедеятельности микробных клеток.

Рост

Координированное воспроизведение всех клеточных компонентов и структур, ведущее в конечном итоге к увеличению массы клетки

Размножение

Увеличение числа клеток в популяции

Выращивание на питательных средах.

В лабораторных условиях микроорганизмы выращивают на питательных средах, которые должны быть стерильными, прозрачными, влажными, содержать определенные питательные вещества (белки, углеводы, витамины, микроэлементы и др.), обладать определенной буферностью, иметь соответствующий рН, окислительно-восстановительный потенциал. 

Таблица 1.1 Химический состав и физиологические функции элементов.

Элемент состава

Характеристика и роль в физиологии клетки.

Вода

Основной компонент бактериальной клетки, составляющий около 80 % ее массы. Она находится в свободном или связанном состоянии со структурными элементами клетки. В спорах количество воды уменьшается до 18.20 %. Вода является растворителем для многих веществ, а также выполняет механическую роль в обеспечении тургора. При плазмолизе – потере клеткой воды в гипертоническом растворе – происходит отслоение протоплазмы от клеточной оболочки. Удаление воды из клетки, высушивание приостанавливают процессы метаболизма. Большинство микроорганизмов хорошо переносят высушивание. При недостатке воды микроорганизмы не размножаются. Высушивание в вакууме из замороженного состояния (лиофилизация) прекращает размножение и способствует длительному сохранению микробных особей.

Белки

40 – 80 % сухой массы. Определяют важнейшие биологические свойства бактерий и состоят обычно из сочетаний 20 аминокислот. В состав бактерий входит диаминопимелиновая кислота (ДАП), отсутствующая в клетках человека и животных. Бактерии содержат более 2000 различных белков, находящихся в структурных компонентах и участвующих в процессах метаболизма. Большая часть белков обладает ферментативной активностью. Белки бактериальной клетки обусловливают антигенность и иммуногенность, вирулентность, видовую принадлежность бактерий.

Элемент состава

Характеристика и роль в физиологии клетки.

Нуклеиновые кислоты

Выполняют функции, аналогичные нуклеиновым кислотам эукариотических клеток: молекула ДНК в виде хромосомы отвечает за наследственность, рибонуклеиновые кислоты (информационная, или матричная, транспортная и рибосомная) участвуют в биосинтезе белка.

Углеводы

Представлены простыми веществами (моно- и дисахариды) и комплексными соединениями. Полисахариды часто входят в состав капсул. Некоторые внутриклеточные полисахариды (крахмал, гликоген и др.) являются запасными питательными веществами.

Липиды

Входят в состав цитоплазматической мембраны и ее производных, а также клеточной стенки бактерий, например наружной мембраны, где, кроме биомолекулярного слоя липидов, имеется ЛПС. Липиды могут выполнять в цитоплазме роль запасных питательных веществ. Липиды бактерий представлены фосфолипидами, жирными кислотами и глицеридами. Наибольшее количество липидов (до 40 %) содержат микобактерии туберкулеза.

Минеральные вещества

Обнаруживают в золе после сжигания клеток. В большом количестве выявляются фосфор, калий, натрий, сера, железо, кальций, магний, а также микроэлементы (цинк, медь, кобальт, барий, марганец и др.).Они участвуют в регуляции осмотического давления, рН среды, окислительно-восстановительного потенциала, активируют ферменты, входят в состав ферментов, витаминов и структурных компонентов микробной клетки.

Таблица 1.2. Азотистые основания.

Азотистые основания

Характеристика

Примечание

Пуриновые

Аденин, Гуанин

Состав нуклеотида: дезоксирибоза, азотистые основания — аденин, гуанин, цитозин, тимин, остаток Н3РО4. Комплементарность азотистых оснований А = Т, Г = Ц. Двойная спираль. Способна к самоудвоению

Пиримидиновые

Цитозин, Тимин или Урацил ( у РНК вместо Тимина)

Таблица 1.2.1 Ферменты

Признак

Характеристика

Определение

Специфичные и эффективные белковые катализаторы, присутствующие во всех живых клетках.

Функции

Ферменты снижают энергию активации, обеспечивая протекание таких химических реакций, которые без них могли бы проходить только при высокой температуре, избыточном давлении и при других нефизиологических условиях, неприемлемых для живой клетки.

Ферменты увеличивают скорость реакции примерно на 10 порядков, что сокращает полупериод какой-либо реакции с 300 лет до одной секунды.

Ферменты «узнают» субстрат по пространственному расположению его молекулы и распределению зарядов в ней. За связывание с субстратом отвечает определённый участок молекулы ферментативного белка — его каталитический центр. При этом образуется промежуточный фермент-субстратный комплекс, который затем распадается с образованием продукта реакции и свободного фермента.

Разновидности

Регуляторные (аллостерические) ферменты воспринимают различные метаболические сигналы и в соответствии с ними изменяют свою каталитическую активность.

Эффекторные ферменты — ферменты катализирующие некоторые реакции (подробнее табл. 1.2.2.)

Функциональная активность

Функциональная активность ферментов и скорость ферментативных реакций зависят от условий, в которых находится данный микроорганизм и прежде всего от температуры среды и ее pH. Для многих патогенных микроорганизмов оптимальными являются температура 37°С и pH 7,2-7,4.

КЛАССЫ ФЕРМЕНТОВ:

  • микроорганизмы синтезируют различные ферменты, принадлежащие ко всем шести известным классам.

Таблица 1.2.2. Классы эффекторных ферментов

Класс фермента

Катализирует:

Оксидоредуктазы

Перенос электронов

Трансферазы

Перенос различных химических групп

Гидролазы

Перенос функциональных групп на молекулу воды

Лиазы

Присоединение групп по двойным связям и обратные реакции

Изомеразы

Перенос групп внутри молекулы с образованием изомерных форм

Лигазы

Образование связей С-С, C-S, С-О, C-N за счёт реакций конденсации, сопряжённых с распадом аденозинтрифосфата (АТФ)

Таблица 1.2.3. Типы ферментов по образованию в бактериальной клетке

Тип

Характеристика

Примечания

Иидуцибельные (адаптивные)

ферменты

«индукция субстратом»

  1. Ферменты, концентрация которых в клетке резко возрастает в ответ на появление в среде субстрата-индуктора.

  2. Синтезируются бактериальной клеткой только при наличии в среде субстрата данного фермента

Репрессибельные ферменты

Синтез этих ферментов подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом.

Примером репрессии ферментов может служить синтез триптофана, который образуется из антраниловой кислоты с участием антранилатсинтетазы.

Конститутивные ферменты

Ферменты, синтезируемые вне зависимости от условий среды

Ферменты гликолиза

Мультиферментные комплексы

Внутриклеточные ферменты, объединенные структурно и функционально

Ферменты дыхательной цепи, локализованные на цитоплазматической мембране.

Таблица 1.2.4. Специфические ферменты

Ферменты

Идентификация бактерий

Супероксид дисмутаза и каталаза

Все аэробы или факультативные анаэробы обладают супероксид дисмутазой и каталазой — ферментами, защищающими клетку от токсичных продуктов кислородного метаболизма. Практически все облигатные анаэробы не синтезируют эти ферменты. Только одна группа аэробных бактерий — молочнокислые бактерии каталазонегативны.

Пероксидаза

Молочнокислые бактерии аккумулируют пероксидазу — фермент, катализирующий окисление органических соединений под действием Н202 (восстанавливается до воды).

Аргининдигидролаза

Диагностический признак, позволяющий различить сапрофитические виды Pseudomonas от фитопатогенных.

Уреаза

Среди пяти основных групп семейства Enterobacteriaceae только две — Escherichiae и Erwiniae— не синтезируют уреазу.

Таблица 1.2.5. Применение ферментов бактерий в промышленной микробиологии.

Ферменты

Применение

Амилаза, целлюлаза, протеаза, липаза

Для улучшения пищеварения применяют готовые препараты ферментов, облегчающих соответственно гидролиз крахмала, целлюлозы, белка и липидов

Инвертаза дрожжей

При изготовлении сладостей для предупреждения кристаллизации сахарозы

Пектиназа

Используют для осветления фруктовых соков

Коллагеназа клостридий и стрептокиназа стрептококков

Гидролизуют белки, способствуют заживлению ран и ожогов

Литические ферменты бактерий

Секретируются в окружающую среду, действуют на клеточные стенки патогенных микроорганизмов и служат эффективным средством в борьбе с последними, даже если они обладают множественной устойчивостью к антибиотикам

Рибонуклеазы, дезоксирибонуклеазы, полимеразы, ДНК-лигазы и прочие ферменты, направленно модифицирующие нуклеиновые кислоты

Используют в качестве инструментария в биоорганической химии, генной инженерии и генотерапии

Таблица 1.2.6. Классификация ферментов по локализации.

Класс

Локализация

Функции

Эндоферменты

  1. В цитоплазме

  2. В цитоплазматической мембране

  3. В периплазматическом пространстве

Функционируют только внутри клетки. Они катализируют реакции биосинтеза и энергетического обмена. 

Экзоферменты 

Выделяются в окружающую среду.

Выделяются клеткой в среду и катализируют реакции гидролиза сложных органических соединений на более простые, доступные для ассимиляции микробной клеткой. К ним относятся гидролитические ферменты, играющие исключительно важную роль в питании микроорганизмов.

Таблица 1.2.7. Ферменты патогенных микробов (ферменты агрессии)

Ферменты

Функция

Образование некоторых ферментов в лабораторных условиях

Лецитовителлаза

= лецитиназа

Разрушает клеточные мембраны

  1. Посев исследуемого материала на питательную среду ЖСА

  2. Результат: зона помутнения вокруг колоний на ЖСА.

Гемолизин

Разрушает эритроциты

  1. Посев исследуемого материала на питательную среду кровяной агар.

  2. Результат: полная зона гемолиза вокруг колоний на кровяном агаре.

Коагулаза-положительные культуры

Вызывает свертывание плазмы крови

  1. Посев исследуемого материала на стерильную цитратную плазму крови.

  2. Результат: свёртывание плазмы

Коагулаза-отрицательные культуры

Выработка маннита

  1. Посев на питательную среду маннит в анаэробных условиях.

  2. Результат: Появление окрашенных колоний (в цвет индикатора)

Ферменты

Функция

Образование некоторых ферментов в лабораторных условиях

Гиалуронидаза

Гидролизирует гиалуроновую ки­слоту — основной компонент соединительной ткани

  1. Посев исследуемого материала на питательную среду, содержащую гиалуроновую кислоту.

  2. Результат: в пробирках, где содержится гиалуронидаза, не происходит образования сгустка.

Нейраминидаза

Отщепляет от различных гликопротеидов, гликолипидов, полисахаридов сиаловую (нейраминовую) ки­слоту, повышая проницаемость различных тканей.

Выявление: реакция определения антител к нейраминидазе (РИНА) и другие (иммунодиффузные, иммуноэнзимные и радиоиммунные методы).

Таблица 1.2.8. Классификация ферментов по биохимическим свойствам.

Ферменты

Функция

Обнаружение

Сахаролитические

Расщепление сахаров

Дифференциально — диагностические среды такие , как среды Гисса , среда Олькеницкого , среда Эндо , среда Левина , среда Плоскирева .

Протеолитические

Расщепление белков

Микробы засевают уколом в столбик желатина и после 3-5 суток инкубирования при комнатной температуре отмечают характер разжижения желатина. Протеолитическую активность определяют также по образованию продуктов разложения белка: индола, сероводорода, аммиака. Для их определения микроорганизмы засевают в мясо-пептонный бульон.

Ферменты, выявляемые по конечным продуктам

  • Образование щелочей

  • Образование кислот

  • Образование сероводорода

  • Образование аммиака и др.

Для отличия одних видов бактерий от других на основании их ферментативной активности применяются дифференциально-диагностические среды

Схема 1.2.8. Ферментный состав.

ФЕРМЕНТНЫЙ СОСТАВ ЛЮБОГО МИКРООРГАНИЗМА:

Определяется его геномом

Является стабильным признаком

Широко применяется для их идентификации

Определение сахаролитических, протеолитических и других свойств.

Таблица 1.3. Пигменты

Пигменты

Синтез микроорганизмом

Жирорастворимые каротиноидные пигменты красного, оранжевого или желтого цветов

Образуют сарцины, микобактерии туберкулеза, некоторые актиномицеты. Эти пигменты предохраняют их от действия УФ-лучей.

Пигменты черного или коричневого цвета — меланины

Синтезируются облигатными анаэробами Bacteroides niger и др. не растворимы в воде и даже сильных кислотах

Пирроловый пигмент ярко-красного цвета, – продигиозин

Образуется некоторыми серациями

Водорастворимый фенозиновый пигмент, – пиоцианин.

Продуцируются синегнойными бактериями

(Pseudomonas aeruginosa). При этом питательная среда с нейтральным или щелочным pH окрашивается в сине-зеленый цвет.

Таблица 1.4. Светящиеся и ароматообразующие микроорганизмы

Явление

Условие и характеристика

Свечение (люминесценция)

Бактерии вызывают свечение тех субстратов, например чешуи рыб, высших грибов, гниющих деревьев, пищевых продуктов, на поверхности которых размножаются. Большинство светящихся бактерий относятся к галофильным видам, способным размножаться при повышенных концентрациях солей. Они обитают в морях и океанах и редко — в пресных водоемах. Все светящиеся бактерии являются аэробами. Механизм свечения связан с освобождением энергии в процессе биологического окисления субстрата.

Ароматообразование

Некоторые микроорганизмы вырабатывают летучие ароматические вещества, например уксусно-этиловый и уксусно-амиловый эфиры, которые придают аромат вину, пиву, молочнокислым и другим пищевым продуктам, вследствие чего применяются в их производстве.

Таблица 2.1.1.Метаболизм

Понятие

Определение

Метаболизм

Биохимические процессы, протекающие в клетке, объединены одним словом — ме­таболизм (греч. metabole — превращение). Этот термин равнозначен понятию «обмен веществ и энергии». Различают две стороны метаболизма: анаболизм и катаболизм.

  1. Анаболизм — совокупность биохимических реакций, осуществляющих синтез компонентов клетки, т. е. та сторона обмена веществ, которую называют конструктивным обменом.

  1. Катаболизм — совокупность реакций, обеспечивающих клетку энергией, необ­ходимой, в частности, и для реакций конструктивного обмена. Поэтому катаболизм определяют еще как энергетический обмен клетки.

Амфиболизм

Промежуточный обмен веществ, превращающий низкомолекулярные фрагменты питательных веществ в ряд органических кислот и фосфорных эфиров, называют

Схема 2.1.1. Метаболизм

МЕТАБОЛИЗМ –

совокупность двух противоположных, но взаимодействующих процессов: катаболизма и анаболизма

со

Анаболизм= ассимиляция = пластический метаболизм = конструктивный метаболизм

Катаболизм= диссимиляция = энергетический метаболизм = распад = обеспечение клетки энергией

Синтез (компонентов клетки)

Ферментативные катаболические реакции, в результате которых происходит выделение энергии, которая аккумулировалась в молекулах АТФ.

Биосинтез мономеров:

аминокислот нуклеотидов моносахаридов жирных кислот

Биосинтез полимеров:

белков нуклеиновых кислот полисахаридов липидов

В результате ферментативных анаболических реакция, энергия, выделенная в процессе катаболизма расходуется на синтез макромолекул органических соединений, из которых потом монтируются биополимеры – составные части микробной клетки.

Энергия расходуется на синтез компонентов клетки

Таблица 2.1.3. Обмен веществ и превращение энергии клетки.

Обмен веществ

Характеристика

Примечания

Функция

Обмен веществ обеспечивает присущее живому организму как системе динамическое равновесие, при котором взаимно уравновешиваются синтез и разрушение, размножение и гибель.

Обмен веществ — главный признак жизни

Пластический обмен

Синтез белков, жиров, углеводов.

Это совокупность реакций биологического синтеза.

Из веществ поступающих в клетку извне, образуются молекулы, подобные соединениям клетки, то есть происходит ассимиляция.

Энергетический обмен

распад

Процесс противоположный синтезу. Это совокупность реакций расщепления.

При расщеплении высокомолекулярных соединений выделяется энергия, необходимая для реакции биосинтеза, то есть происходит диссимиляция.

  • При расщеплении глюкозы энергия выделяется поэтапно при участии ряда ферментов.

Таблица 2.1.2. Различие в метаболизме для идентификации.

Параметры

Способность к утилизации различных веществ в качестве источника углерода.

Способность к образованию специфических конечных продуктов в результате разложения субстратов.

Способность смешать рН среды культивирования в кислую или щелочную сторону. Метаболизм большинства бактерий осуществляется посредством биохимических реакций разложения органических (реже неорганических) веществ и синтеза компонентов бактериальной клетки из простых углеродсодержащих соединений.

Таблица 2.2 Анаболизм (конструктивный метаболизм)

Группа реакций анаболизма

Синтезируются:

Биосинтез мономеров

Аминокислот, нуклеотидов, моносахаров, жирных кислот

Био­синтез полимеров

Белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов

Схема 2.2.2. Биосинтез аминокислот у прокариот.

Автор – Л.Б. Борисов, стр. 52 «Медицинская микробиология»

большинство патогенных микроорганизмов выращивают

Схема 2.2.1. Биосинтез углеводов у микроорганизмов.

большинство патогенных микроорганизмов выращивают

Автор – Л.Б. Борисов, стр. 51 «Медицинская микробиология»

Рисунок 2.2.3. Биосинтез липидов

большинство патогенных микроорганизмов выращивают

Таблица 2.2.4. Этапы энергетического обмена – Катаболизм.

Этапы

Характеристика

Примечание

Подготовительный

Молекулы дисахаридов и полисахаридов, белков распадаются на мелкие молекулы – глюкозу, глицерин и жирные кислоты, аминокислоты. Крупные молекулы нуклеиновых кислот на нуклеотиды.

На этом этапе выделяется небольшое количество энергии, которая рассеивается в виде теплоты.

Бескислородный или неполный или анаэробный или брожение или диссимиляция.

Образующиеся на этом этапе вещества при участии ферментов подвергаются дальнейшему расщеплению.

Например: глюкоза распадается на две молекулы молочной кислоты и две молекулы АТФ.

В реакциях расщепления глюкозы участвует АТФ и H3PO4. В ходе бескислородного расщепления глюкозы в виде химической связи в молекуле АТФ сохраняется 40 % энергии, остальная рассеивается в виде теплоты.

Во всех случаях распада одной молекулы глюкозы образовывается две молекулы АТФ.

Стадия аэробного дыхания или кислородного расщепления.

При доступе кислорода к клетке образовавшиеся во время предыдущего этапа вещества окисляются (расщепляются) до конечных продуктов CO и HO.

Суммарное уравнение аэробного дыхания:

большинство патогенных микроорганизмов выращивают

Схема 2.2.4. Брожение.

Бродильный метаболизм –характеризуется образованием АТФ посредством фосфорилирования субстратов.

  1. Первая (окисление) = расщепление

  1. Вторая (восстановление)

Включает превращения глюкозы в пировиноградную кислоту.

Включает утилизацию водорода для восстановления пировиноградной кислоты.

Пути образования пировиноградной кислоты из углеводов

Схема 2.2.5. Пировиноградная кислота.

Гликолитический путь (путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса)

Путь Энтнера-Дудорова

Пентозо-фосфатный путь

Таблица 2.2.5. Брожение.

Тип брожения

Представители

Конечный продукт

Примечания

Молочнокислое

  • Streptococcus

  • Bifidobacterium

  • Lactobacterium

Образуют из пирувата молочную кислоту

В одних случаях (гомоферментное брожение) образуется только молочная кислота, в других также побочные продукты.

Муравьинокислое

  • Enterobacteriaceae

Муравьиная кислота – один из конечных продуктов . (наряду с ней – побочные)

Некоторые виды энтеробактерий расщепляют муравьиную кислоту до H2 иCO2/

Маслянокислое

  • Clostridium

Масляная кислота и побочные продукты

Некоторые вид ы клостридий наряду с масляной и другими кислотами образуют бутанол, ацетон и др. (тогда его называют ацетоно-бутиловое брожение).

Пропионовокислое

  • Propionobacterium

Образуют из пирувата пропионовую кислоту

Многие бактерии при сбраживании углеводов наряду с другими продуктами образуют этиловый спирт. При этом он не является основным продуктом.

Таблица 2.3.1. Белоксинтезирующая система, ионный обмен.

Название элемента

Характеристика

Рибосомные субъединицы 30S и 50S

 В случае бактериальных рибосом 70S субчастица 50S содержит рРНК 23S (длина ~3000 нуклеотидов) и субчастица 30S содержит рРНК 16S (длина ~1500 нуклеотидов); большая рибосомная субчастица кроме «длинной» рРНК содержит также одну или две «коротких» рРНК (5S рРНК бактериальных рибосомных субчастиц 50S или 5S и 5.8S рРНК больших рибосомных субчастиц эукариот). (подробнее – см. рис. 2.3.1.)

 Матричная РНК (мРНК)

РНК, содержащая информацию о первичной структуре (аминокислотной последовательности) белков

Полный комплект двадцати аминоацил-тРНК, для образования которых необходимы соответствующие аминокислоты, аминоацил-тРНК-синтетазы, тРНК и АТФ

Это заряженная энергией и связанная с тРНК аминокислота, готовая для подвоза к рибосоме и включения в синтезирующийся на ней полипептид.

Транспортная РНК (тРНК)

Рибонуклеиновая кислота, функцией которой является транспортировка аминокислот к месту синтеза белка.

 Белковые факторы инициации

(у прокариот — IF-1, IF-2, IF-3) Получили свое название потому, что они участвуют в организации активного комплекса (708-комплекса) из субъединиц 30S и 50S, мРНК и инициаторной аминоацил-тРНК (у прокариот — формилметионил-тРНК), который «запускает» (инициирует) работу рибосом — трансляцию мРНК.

 Белковые факторы элонгации

(у прокариот — EF-Tu, EF-Ts, EF-G) Участвуют в удлинении (элонгации) синтезируемой полипептидной цепи (пептидила). Белковые факторы терминации или освобождения (англ. — release factors — RF) обеспечивают кодон-специфическое отделение полипептида от рибосомы и окончание синтеза белка.

Название элемента

Характеристика

Белковые факторы терминации

 (у прокариот — RF-1, RF-2, RF-3)

Некоторые другие белковые факторы (ассоциации, диссоциации субъединиц, высвобождения и пр.).

Белковые факторы трансляции, необходимые для функционирования системы

Гуанозинтрифосфат (ГТФ)

Для осуществления трансляции необходимо участие ГТФ. Потребность белок­синтезирующей системы в ГТФ очень специфична: он не может быть заменен ни одним из других трифосфатов. На биосинтез белка клетка затрачивает энергии больше, чем на синтез любого другого биополимера. Образование каждой новой пептидной связи требует расщепления четырех высокоэнергетических связей (АТФ и ГТФ): двух для того, чтобы нагрузить аминокислотой молекулу тРНК, и еще двух в ходе элонгации — одну при связывании аа-тРНК и другую при транслокации.

 Неорганические катионы в определенной концентрации.

Для поддержания рН системы в физиологических пределах. Ионы аммония используются некоторыми бактериями для синтеза аминокислот, ионы калия — для связывания тРНК с рибосомами. Ионы железа, магния выполняют роль кофактора в ряде ферментативных процессов

Рисунок 2.3.1. Схематическое изображение структур прокариотических и эукариотических рибосом.

Автор – Коротяев, стр. 68 «Медицинская микробиология»

большинство патогенных микроорганизмов выращивают

Таблица 2.3.2. Особенности ионного обмена у бактерий.

Особенность

Характеризуется:

Высокое осмотическое давление

Благодаря значительной внутриклеточной концентрации ионов калия в бактериях поддерживается высокое осмотическое давление.

Потребление железа

Для ряда патогенных и условно-патогенных бактерий (эшерихии, шигеллы и др.) потребление железа в организме хозяина затруднено из-за его нерастворимости при нейтральных и слабощелочных значениях pH

Сидерофоры – специальные вещества, которые, связывая железо, делают его растворимым и транспортабельным.

Ассимиляция

Бактерии активно ассимилируют из среды анионы SO2/ и Р034+ для синтеза соединений, содержащих эти элементы (серосодержащие аминокислоты, фосфолипиды и др.).

Ионы

Для роста и размножения бактерий необходимы минеральные соединения — ионы NH4+, К+, Mg2+ и др. (подробнее, смотри табл. 2.3.1.)

Таблица 2.3.3. Ионный обмен

Название минеральных соединений

Функция

NH4+ (ионы аммония)

Используются некоторыми бактериями для синтеза аминокислот

K+(ионы калия)

  1. Используются для связывания т-РНК с рибосомами

  2. Поддерживают высокое осмотическое давление

Fe2+ (ионы железа)

  1. Выполняют роль кофакторов в ряде ферментативных процессов

  2. Входят в состав цитохромов и других гемопротеидов

Mg2+ (ионы магния)

SO42- (сульфат-анион)

Необходимы для синтеза соединений, содержащих эти элементы (серосодержащие аминокислоты, фосфолипиды и др.)

PO43-(фосфат-анион)

Схема 2.4.1. Энергетический метаболизм.

Для синтеза бактерии нуждаются в…

  1. Питательных веществах

  1. Энергии

Таблица 2.4.1. Энергетический метаболизм (биологическое окисление).

Процесс

Необходимо:

Синтез структурных компонентов микробной клетки и поддержание процессов жизнедеятельности

Достаточное количество энергии.

Эта потребность удовлетворяется за счет биологического окисления, в результате которого синтезируются молекулы АТФ.

Энергия (АТФ)

Железобактерии получают энергию, выделяющуюся при непосредственном окислении ими железа (Fe2+ в Fe3+), которая используется для фиксации С02, бактерии, метаболизирующие серу, обеспечивают себя энергией за счет окисления серосодержащих соединений. Однако подавляющее большинство прокариот получает энергию путем дегидрогенирования.

Получение энергии происходит также в процессе дыхания (подробную таблицу смотри в соответствующем разделе).

Схема 2.4. Биологическое окисление у прокариот.

Распад полимеров на мономеры

I этап

Белки

Жиры

Углеводы

глицерин и жирные кислоты

аминокислоты

моносахариды

Расщепление в бескислородных условиях

II этап

Образование промежуточных продуктов

Окисление в кислородных условиях до конечных продуктов

III этап

CO2

H2O

Таблица 2.4.2. Энергетический метаболизм.

Понятие

Характеристика

Сущность энергетического метаболизма

Обеспечение энергией клеток, необходимой для проявления жизни.

АТФ

Молекула АТФ синтезируется в результате переноса электрона от его первичного донора до конечного акцептора.

Дыхание

  • Дыхание – биологическое окисление (расщепление).

  • В зависимости от того, что является конечным акцептором электронов различают дыхание:

  1. Аэробное – при аэробном дыхании конечным акцептором электронов служит молекулярный кислород O2.

  2. Анаэробное – конечным акцептором электронов служат неорганические соединения: NO3-,SO3-,SO42-

Мобилизация энергии

Энергия мобилизуются в реакциях окисления и восстановления.

Реакция Окисления

Способность вещества отдавать электроны (окисляться)

Реакция Восстановления

Способность вещества присоединять электроны.

Окислительно-восстановительный потенциал

Способность вещества отдавать (окисляться) или принимать (восстанавливаться) электроны. (количественно выражение)

Схема 2.5. Синтез.

СИНТЕЗ

белков

жиров

углеводов

Таблица 2.5.1. Синтез

Название

Характеристика

Цитоплазма

В цитоплазме происходит синтез исходных продуктов.

Цитоплазматическая мембрана

Исходные продукты из цитоплазмы переносятся на наружную поверхность цитоплазматической мембраны.

Морфогенез

На ЦПМ начинается морфогенез, то есть образование клеточных структур (капсул, клеточной стенки и др.) при участии ферментов.

Таблица 2.5.1. Синтез

Биосинтез

Из чего

Примечания

I

Биосинтез углеводов

Автотрофы синтезируют глюкозу из CO2. Гетеротрофы синтезируют глюкозу из углеродсодержащих соединений.

Цикл Кальвина (см. схему 2.2.1.)

II

Биосинтез аминокислот

Большинство прокариот способны синтезировать все аминокислоты из:

  • Пирувата

  • α-кетоглутората

  • фумората

Источник энергии – АТФ. Пируват образуется в гликолитическом цикле.

Ауксотрофные микроорганизмы – потребляют готовые в организме хозяина.

III

Биосинтез липидов

Липиды синтезируются из более простых соединений — продуктов метаболизма белков и углеводов

Важную роль играют ацетилпереносящие белки.

Ауксотрофные микроорганизмы – потребляют готовые в организме хозяина или из питательных сред.

Таблица 2.5.2. Основные этапы биосинтеза белка.

Этапы

Характеристика

Примечания

Транскрипция

Процесс синтеза РНК на генах.

Это процесс переписывания информации с ДНК – гена на мРНК – ген.

Осуществляется с помощью ДНК – зависимой РНК – полимеразы.

Перенос информации о структуре белка к рибосомам происходит с помощью мРНК.

Трансляция (передача)

Процесс собственного биосинтеза белка.

Процесс расшифровки генетического кода в мРНК и осуществление его в виде полипептидной цепи.

Поскольку каждый кодон содержит три нуклеотида, один и тот же генетический текст можно прочитать тремя разными способами (начиная с первого, второго и третьего нуклеотидов), то есть в трех разных рамках считывания.

  • Примечание к таблице: Первичная структура каждого белка – последовательность расположения в нём аминокислот.

Схема 2.5.2. Цепи переноса электронов от первичного донора водорода (электронов) до конечного его акцептора O2 .

Органическое вещество

(первичный донор электронов)

NAD ( — 0,32 )

Флавопротеин (- 0,20)

Хинон (- 0, 07)

Цитохром (+0,01)

Цитохром C(+0,22)

Цитохром A(+0,34)

O2 (+0,81)

конечный акцептор

Таблица 3.1. Классификация организмов по типам питания.

Элемент-органоген

Типы питания

Характеристика

Углерод (С)

  1. Аутотрофы

Сами синтезируют все углеродосодержащие компоненты клетки из CO2.

  1. Гетеротрофы

Не могут удовлетворять свои потребности за счёт CO2, используют готовые органические соединения.

  1. Сапрофиты

Источник питания – мёртвые органические субстраты.

  1. Паразиты

Источник питания – живые ткани животных и растений.

Азот (N)

  1. Прототрофы

Удовлетворяют свои потребности с помощью атмосферного и минерального азота

  1. Ауксотрофы

Нуждаются в готовых органических азотистых соединениях.

Водород (H)

Основным источником является H2O

Кислород (O)

Таблица 3.1.2. Превращение энергии

Классификация

Название

Требуется:

По источнику энергии

  1. Фототрофы

Солнечный свет

  1. Хемотрофы

Окислительно-восстановительные реакции

По донору электронов

  1. Литотрофы

Неорганические соединения (H2,H2S,NH3,Feи др.)

  1. Органотрофы

Органические соединения

Таблица 3.1.3. Способы углеродного питания

Источник энергии

Донор электронов

Способ углеродного питания

Энергия солнечного света

Неорганические соединения

Фотолитогетеротрофы

Органические соединения

Фотоорганогетеротрофы

Окислительно-восстановительные реакции

Неорганические соединения

Хемолитогетеротрофы

Органические соединения

Хемоорганогетеротрофы

Таблица 3.2. Механизмы питания:

Механизм

Условия

Градиент концентрации

Затраты энергии

Субстратная специфичность

Пассивная диффузия

Концентрация питательных веществ в среде превышает концентрацию в клетке.

По градиенту концентрации

Облегчённая диффузия

Участвуют белки пермеазы.

По градиенту концентрации

+

Активный транспорт

Участвуют белки пермеазы.

Против градиента концентрации

+

+

Транслокация химических групп

В процессе переноса происходит химическая модификация питательных веществ.

Против градиента концентрации

+

+

Таблица 3.3. Транспорт питательных веществ из бактериальной клетки.

Название

Характеристика

Фосфотрансферазная реакция

Происходит при фосфорилировании переносимой молекулы.

Контрансляционная секреция

В этом случае синтезируемые молекулы должны иметь особую лидирующую последовательность аминокислот, чтобы прикрепиться к мембране и сформировать канал, через который молекулы белка смогут выйти в окружающую среду. Таким образом выходят из клетки соответствующих бактерий токсины столбняка, дифтерии и другие молекулы

Почкование мембраны

Молекулы, образующиеся в клетке, окружаются мембранным пузырьком, который отшнуровывается в окружающую среду.

Таблица 4. Рост.

Понятие

Определение понятия.

Рост

Необратимое увеличение количества живого вещества, наиболее часто обусловленное делением клеток. Если у многоклеточных организмов обычно наблюдается увеличение размеров тела, то у многоклеточных увеличивается количество клеток. Но и у бактерий следует выделять увеличение количества клеток и увеличение клеточной массы.

Факторы, влияющие на рост бактерий invitro.

  1. Культуральные среды:

  • Синтетические, натуральные, полусинтетические (по происхождению)

  • Простые и сложные (по составу)

  • Жидкие, плотные, полужидкие (по консистенции)

  • Накопительные

  • Элективные, основные, дифференциально-диагностические (по целевому назначению)

Mycobacterium leprae не способны in vitro к

Chlamydia росту (внутрикл. паразиты)

  1. Температура (растут в интервале):

  • Мезофильные бактерии (20-40оС)

  • Термофильные бактерии (50-60оС)

  • Психрофильные (0-10оС)

Оценка роста бактерий

Количественную оценку роста обычно проводят в жидких средах, где растущие бактерии образуют гомогенную суспензию. Увеличение количества клеток устанавливают, определяя концентрацию бактерий в 1 мл, либо определяют увеличение клеточной массы в весовых единицах, отнесённых к единице объёма.

Факторы роста

Липиды

Аминокислоты

Витамины

Азотистые основания

Таблица 4.1. Факторы роста

Факторы роста

Характеристика

Функция

Аминокислоты

  1. Лейцин

  2. Тирозин

  3. Аргинин

Многие микроорганизмы, особенно бактерии, нуждаются в тех или других аминокислотах (одной или нескольких), поскольку они не могут их самостоятельно синтезировать. Такого рода микроорганизмы называются ауксотрофными по тем аминокислотам или другим соединениям, которые они не способны синтезировать.

Пуриновые основания и их производные

Нуклеотиды:

  1. Аденин

  2. Гуанин

Являются факторами роста бактерий. В нуклеотидах нуждаются некоторые виды микоплазм. Требуются для построения нуклеиновых кислот.

Пиримидиновые основания и их производные

Нуклеотиды

  1. Цитозин

  2. Тимин

  3. Урацил

Факторы роста

Характеристика

Функция

Липиды

  1. Нейтральные липиды

Входят в состав мембранных липидов

  1. Фосфолипиды

  1. Жирные кислоты

Являются компонентами фосфолипидов

  1. Гликолипиды

У микоплазм входят в состав цитоплазматической мембраны

  1. Стеролы

Витамины

(в основном группы B)

  1. Тиамин (B1)

Золотистый стафилококк, пневмококк, бруцеллы

  1. Никотиновая кислота (B3)

 Все виды палочковидных бактерий

  1. Фолиевая кислота (B9)

Бифидобактерии и пропионовокислые

  1. Пантотеновая кислота (B5)

Некоторые виды стрептококков, бациллы столбняка

  1. Биотин ( B7)

Дрожжи и азотфиксирующие бактерий Rhizobium

Гемы – компоненты цитохромов

Гемофильным бактериям, микобактериям туберкулеза

Таблица 5. Дыхание.

Название

Характеристика

Дыхание

Биологическое окисление (ферментативные реакции)

Основание

Дыхание основано на окислительно-восстановительных реакциях, идущих с образованием АТФ – универсального аккумулятора химической энергии.

Процессы

При дыхании происходят процессы:

  • Окисление – отдача донорами водорода или электронов.

  • Восстановление – присоединение водорода или электронов к акцептору.

Аэробное дыхание

Конечным акцептором водорода или электронов служит молекулярный кислород.

Анаэробное дыхание

Акцептором водорода или электронов является неорганическое соединение – NO3-,SO42-,SO32-.

Брожение

Акцептором водорода или электронов являются органические соединения.

Таблица 5.1. Классификация по типу дыхания.

Бактерии

Характеристика

Примечания

Строгие анаэробы

  • Энергетический обмен происходит без участия свободного кислорода.

  • Синтез АТФ при потреблении глюкозы в анаэробных условиях (гликолиз) происходит за счет фосфорилирования субстрата.

  • Кислород для анаэробов не служит конечным акцептором электронов. Более того, молекулярный кислород оказывает на них токсическое действие

  • у строгих анаэробов отсутствует фермент каталаза, поэтому накапливающаяся в присутствии кислорода оказывает на них бактерицидное действие;

  • у строгих анаэробов отсутствует система регуляции окислительно-восста­новительного потенциала (редокс-потенциала).

Строгие аэробы

  • Способны получать энергию только путём дыхания и поэтому обязательно нуждаются в молекулярном кислороде.

  • Организмы, получающие энергию и образующие АТФ при помощи только окислительного фосфорилирования субстрата, где окислителем может выступать только молекулярный кислород. Рост большинства аэробных бактерий прекращается при концентрации кислорода в 40—50 % и выше.

К строгим аэробам относят, например, представителей рода Pseudomonas

Бактерии

Характеристика

Примечания

Факультативные анаэробы

  • Растут как в присутствии, так и в отсутствии молекулярного кислорода

  • Аэробные организмы содержат чаще всего три цитохрома, факультативные анаэробы — один или два, облигатные анаэробы не содержат цитохромов.

К факультативным анаэробам относят энтеробактерии и многие дрожжи, способные переключаться с дыхания в присутствии 02на брожение в отсутствии 02.

Микроаэрофилы

Микроорганизм, требующий, в отличие от строгих анаэробов, для своего роста присутствия кислорода в атмосфере или питательной среде, но в пониженных концентрациях по сравнению с содержанием кислорода в обычном воздухе или в нормальных тканях организма хозяина (в отличие от аэробов, для роста которых необходимо нормальное содержание кислорода в атмосфере или питательной среде). Многие микроаэрофилы так же являются капнофилами, то есть им требуется повышенная концентрация углекислого газа.

 В лаборатории такие организмы легко культивируются в «свечной банке». «Свечная банка» это ёмкость, в которую перед запечатыванием воздухонепроницаемой крышкой вносят горящую свечу. Пламя свечи будет гореть до тех пор, пока не потухнет от недостатка кислорода, в результате чего в банке образуется атмосфера, насыщенная диоксидом углерода, с пониженным содержанием кислорода.

Таблица 6. Характеристика размножения.

Название

Характеристика

Размножение

Термином «размножение» обозначают увеличение числа клеток в популяции. Большинство прокариот размножаются поперечным делением, некоторые почкованием. Грибы размножаются путем спорообразования.

Где происходит

При размножении микробной клетки наиболее важные процессы происходят в ядре (нуклеоиде), содержащем всю генетическую информацию в двунитевой молекуле ДНК

Схема 6. Зависимость продолжительности генерации от различных факторов.

Продолжительность генерации

Вид бактерии

Возраст

Популяция

Температура

Состав питательной среды

Таблица 6.1. Фазы размножения бактерий.

Фаза

Характеристика

I

Исходная стационарная фаза

Продолжается 1-2 часа. В течение данной фазы число бактериальных клеток не увеличивается.

II

Лаг-фаза (фаза задержки размножения)

Характеризуется началом интенсивного роста клеток, но скорость их деления остается невысокой.

III

Лог-фаза (логарифмическая)

Отличается максимальной скоростью размножения клеток и увеличением численности бактериальной популяции в геометрической прогрессии

IV

Фаза отрицательного ускорения

Характеризуется меньшей активностью бактериальных клеток и удлинением периода генерации. Это происходит в результате истощения питательной среды, накопления в ней продуктов метаболизма и дефицита кислорода.

V

Стационарная фаза

Характеризуется равновесием между количеством погибших, вновь образующихся и находящихся в состоянии покоя клеток.

VI

Фаза гибели

Происходит в постоянной скоростью и сменяется УП-УШ фазами уменьшения скорости отмирания клеток.

Схема 7. Требования к питательным средам.

Требования

Вязкость

Влажность

Стерильность

Питательность

Прозрачность

Изотоничность

pH среды

Таблица 7. Размножение бактерий на питательных средах.

Питательная среда

Характеристика

Плотные питательные среды

На плотных питательных средах бактерии образуют колонии – скопления клеток.

S – тип (smooth – гладкий и блестящий)

Круглые, с ровным краем, гладкие, выпуклые.

R – тип (rough – шершавый, неравный)

Неправильной формы с изрезанными краями, шероховатые, вмятые.

Жидкие питательные среды

  • Придонный рост (осадок)

  • Поверхностный рост (плёнка)

  • Диффузный рост (равномерное помутнение)

Таблица 7.1. Классификация питательных сред.

Классификация

Виды

Примеры

По составу

Простые

  1. МПА – мясо-пептонный агар

  2. МПБ – мясо-пептонный бульон

  3. ПВ – пептонная вода

Сложные

  1. Кровяной агар

  2. ЖСА – желточно-солевой агар

  3. Среды Гисса

По назначению

Основные

  1. МПА

  2. МПБ

Элективные

  1. ЖСА

  2. Щелочной агар

  3. Щелочная пептонная вода

Дифференциально — диагностические

  1. Эндо

  2. Левина

  3. Плоскирева

  4. Гисса

  5. Ресселя

Специальные

  1. Вильсона-Блера

  2. Китта-Тароцци

  3. Тиогликолевый бульон

  4. Молоко по Тукаеву

По консистенции

Плотные

  1. Кровяной агар

  2. Щелочной агар

Жидкие

  1. МПБ

  2. ПВ

Полужидкие

  1. Полужидкий агар

По происхождению

Натуральные

  1. МПА

  2. МПБ

Полусинтетические

  1. Эндо

  2. Сабуро

Синтетические

  1. Коззера

  2. Симмонсона

Таблица 7.2. Принципы выделения чистой культуры клеток.

Механический принцип

Биологический принцип

МЕТОДЫ

1. Фракционных разведений Л. Пастера

2. Пластинчастых разведений Р. Коха

3. Поверхностных посевов Дригальського

4. Поверхностных штрихов

МЕТОДЫ

Приймают во внимание:

а — тип дыхания (метод Фортнера);

б — подвижность (метод Шукевича);

в — кислотоустойчивость;

г — спорообразование;

д — температурный оптимум;

е  —  избирательную  чувствительность лабораторных животных к бактериям

Таблица 7.2.1. Этапы выделения чистой культуры клеток.

Этап

Характеристика

1 этап исследования

Забирают патологический материал. Его изучают — внешний вид, консистенция, цвет, запахом и другие признаки, готовят мазок, красят и исследуют под микроскопом.

2 этап исследования

На поверхности плотной питательной среды микроорганизмы образуют сплошной, густой рост или изолированные колонии. Колония – это видимые невооруженным глазом скопления бактерий на поверхности или в толще питательной среды. Как правило, каждая колония формируется из потомков одной микробной клетки (клоны), потому их состав достаточно однороден. Особенности роста бактерий на питательных средах являются проявлением их культуральных свойств.

3 этап исследования

Изучают характер роста чистой культуры микроорганизмов и проводят ее идентификацию.

Таблица 7.3. Идентификация бактерий.

Название

Характеристика

Биохимическая идентификация

Определение вида возбудителя по его биохимическим свойствам

Серологическая идентификация

С целью установления видовой принадлежности бактерий часто изучают их антигенное строение, то есть проводят идентификацию по антигенным свойствам

Идентификация по биологическим свойствам

Иногда идентификацию бактерий проводят, заражая лабораторных животных чистой культурой и наблюдая за теми изменениями, которые вызывают возбудители в организме

Культуральная идентификация

Определения вида возбудителей по их культуральным признакам

Морфологическая идентификация

Определение вида бактерий по их морфологическим признакам

Тесты рейтингового контроля

  1. Какой из процессов не относится к физиологии бактерий?

  1. Рост

  2. Размножение

  3. Мутация

  4. Питание

  1. Какие вещества составляют 40 – 80 % сухой массы бактериальной клетки?

  1. Углеводы

  2. Белки

  3. Жиры

  4. Нуклеиновые кислоты

  1. Какие классы ферментов синтезируют микроорганизмы?

  1. Оксиредуктазы

  2. Все классы

  3. Трансферазы

  4. Лигазы

  1. Ферменты, концентрация которых в клетке резко возрастает в ответ на появление в среде субстрата-индуктора?

  1. Иидуцибельные

  2. Конституционные

  3. Репрессибельные

  4. Мультиферментные комплексы

  1. Фермент патогенности, выделяемый золотистым стафилококком?

  1. Нейраминидаза

  2. Гиалуронидаза

  3. Лецитиназа

  4. Фибринолизин

  1. Протеолитические ферменты выполняют функцию?

  1. Расщепление белков

  2. Расщепление жиров

  3. Расщепление углеводов

  4. Образование щелочей

  1. Брожение энтеробактерий?

  1. Молочнокислое

  2. Муравьинокислое

  3. Пропионовокислое

  4. Маслянокислое

  1. Какие минеральные соединения используются для связывания т-РНК с рибосомами?

  1. NH4

  2. K+

  3. Fe2+

  4. Mg2+

  1. Биологическое окисление это…?

  1. Питание

  2. Размножение

  3. Дыхание

  4. Гибель клеток

  1. Какие вещества сами синтезируют все углеродосодержащие компоненты клетки из CO2.

  1. Прототрофы

  2. Гетеротрофы

  3. Автотрофы

  4. Сапрофиты

  1. Питательные среды различаются:

  1. По составу

  2. По консистенции

  3. По назначению

  4. По всему из вышеперечисленного

  1. Фаза размножения, которая характеризуется равновесием между количеством погибших, вновь образующихся и находящихся в состоянии покоя клеток?

  1. Лаг-фаза

  2. Лог-фаза

  3. Фаза отрицательного ускорения

  4. Стационарная фаза

  1. Продолжительность генерации зависит от?

  1. Вида

  2. Возраста

  3. Популяции

  4. Всего вышеперечисленного

  1. С целью установления видовой принадлежности бактерий часто изучают их антигенное строение, то есть проводят идентификацию, какую?

  1. Биологическую

  2. Морфологическую

  3. Серологическую

  4. Биохимическую

  1. Метод поверхностных посевов Дригальского относят к…?

  1. Механическим принципам выделения чистой культуры

  2. Биологическим принципам выделения чистой культуры

Список литературы

1. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология: учебник для мед. вузов. – М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2005.

2. Поздеев О. К. Медицинская микробиология: учебник для мед. вузов. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2005.

3. Коротяев А. И., Бабичев С. А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология / учебник для мед. вузов. – Спб.: СпецЛит, 2000.

4.Воробьев А. А., Быков А. С., Пашков Е. П., Рыбакова А. М. Микробиология: учебник. – М.: Медицина, 2003.

5. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник / под ред. В. В. Зверева, М. Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАр-Медиа, 2014.

6. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии / под ред. В. В. Теца. – М.: Медицина, 2002.

Содержание

Введение 6

Состав бактерий с точки зрения их физиологии. 7

Метаболизм 14

Питание (транспорт питательных веществ) 25

Рост 29

Дыхание 31

Размножение 34

Микробные сообщества 37

ПРИЛОЖЕНИЯ 49

Тесты 102

Список литературы 105

…………..

…………

Некоторые заболевания человека связаны с воздействием на его организм микробов. При возникновении таких заболеваний в организме человека происходят сложные изменения, мобилизуются защитные функции, направленные на борьбу с попавшими микробами.

Среди огромного количества микроорганизмов встречаются такие, которые способны вызывать заболевания человека, животных и растений. Они получили название патогенных или болезнетворных. Для патогенных микроорганизмов характерна специфичность — каждый вид их способен вызывать только определенную болезнь со всеми характерными для нее признаками. Большинство патогенных микроорганизмов является микробами паразитами, так как они способны жить за счет веществ живого организма.

Патогенные микробы вырабатывают особые вещества — токсины, которые отравляют организм и являются причиной болезненного состояния. Способность микроорганизмов вызывать заболевание называется патогенностью. Она может проявляться в разной степени. Степень патогенности называют вирулентностью. Вирулентность микробов может усиливаться или ослабевать как в естественных, так и в экспериментальных условиях.

Под термином «инфекция» понимают процесс взаимодействия микробов с организмом человека, в результате которого возникает инфекционное заболевание. Источниками инфекции являются, прежде всего, больные люди и животные, выделяющие болезнетворные микроорганизмы во внешнюю среду, а также переболевшие люди и животные, в организме которых болезнетворные микробы продолжают оставаться некоторое время (иногда очень длительное) после выздоровления. Люди и животные, выделяющие патогенных микробов после выздоровления, называются бактерионосителями или бактериовыделителями. Бактерионосителями могут быть и не болевшие люди. Выделенные больным организмом патогенные микробы попадают в воздух, почву, воду, на окружающие предметы и продукты питания, где они могут оставаться жизнеспособными более или менее длительное время, что зависит от вида микробов.

В организм человека патогенные микробы проникают различными путями: посредством прямого контакта с больным человеком— через воздух с мельчайшими капельками слизи и слюны, выделяемыми больным при кашле или чихании (капельная инфекция). Микробы — возбудители некоторых болезней — выделяются больными с испражнениями и мочой. Такие микробы попадают в организм здорового человека через грязные руки, не вымытые после пользования туалетом. С загрязненных рук болезнетворные микроорганизмы попадают и на пищевые продукты. Возбудители кишечных инфекций проникают в здоровый организм также при употреблении загрязненной воды.

Переносчиками инфекционных заболеваний часто являются насекомые и грызуны. Мухи могут переносить возбудителей брюшного тифа и дизентерии, вши — сыпного тифа, некоторые виды комаров — малярии и т. д. Мыши и крысы являются распространителями возбудителей чумы, туляремии, сибирской язвы.

Проникновение болезнетворных микробов в организм человека не всегда приводит к его заболеванию. В возникновении и течении болезни большую роль играют свойства проникших е организм патогенных микробов, их количество и активность, а также место их внедрения в организм и состояние самого организма.

Для размножения патогенных микроорганизмов нужны благоприятные условия, а они проявляются тогда, когда организм человека ослаблен и его защитная способность понижена (вследствие переохлаждения, голодания и т. д.). Восприимчивость к инфекциям зависит также от возраста (у детей и стариков она более высокая, чем у взрослых).

С момента проникновения патогенных микробов в организм человека до появления признаков болезни обычно проходит некоторый период времени — называют скрытым периодом болезни, или инкубационным. За это время происходит размножение патогенных микробов в организме и накопление вредных продуктов их жизнедеятельности. Продолжительность инкубационного периода разных болезней неодинакова. Она колеблется от нескольких дней (грипп, столбняк, дизентерия) до нескольких недель (сыпной тиф, брюшной тиф), а иногда достигает нескольких месяцев (бешенство) и даже лет (проказа).

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

    Питательные среды — субстраты, состоящие из компонентов, обеспечивающих необходимые условия для культивирования микроорганизмов или накопления продуктов их жизнедеятельности

.

    Питательные среды различаются по назначению, консистенции и составу. По назначению их условно подразделяют на две основные группы — диагностические и производственные среды. Диагностические питательные среды включают пять подгрупп: среды для выращивания широкого спектра микроорганизмов; среды для выделения конкретного возбудителя; дифференциальные среды, позволяющие различать отдельные виды микроорганизмов; среды для идентификации микроорганизмов и накопительные среды, предназначенные для обогащения конкретного вида микроорганизмов. К числу производственных относятся П. с. , используемые при промышленном изготовлении медицинских биологических препаратов (бактериальных вакцин, анатоксинов и др.) и контроле их качества. Питательные среды для производства бактерийных препаратов в отличие от диагностических сред не должны содержать вредных для человека примесей и оказывать отрицательного влияния на процесс производства (не препятствуя, в частности, удалению из изготавливаемых препаратов продуктов микробного метаболизма, балластных органических и минеральных веществ).

    По консистенции различают жидкие, плотные и полужидкие среды. Плотные и полужидкие питательные среды готовят из жидких посредством прибавления к ним агара или (реже) желатина. Агар-агар — полисахарид, получаемый из определенных сортов морских водорослей. Агар обычно вносят в П. с. в концентрации 1—2% (при изготовлении полужидких сред — 0,2—0,4%), желатин — 10—15%. При t° 25—30° желатиновые среды плавятся, поэтому микроорганизмы на них выращивают преимущественно при комнатной температуре. В качестве плотных сред применяют также свернутую сыворотку крови, свернутые яйца, картофель и среды, содержащие 1,5% силикагеля.

    По составу питательные среды делят на простые и сложные. Простые П. с. обеспечивают питательные потребности большинства патогенных микроорганизмов (мясопептонный бульон, мясопептонный агар, бульон и агар Хоттингера, питательный желатин, пептонная вода и др.). К сложным относят специальные среды для микробов, которые не растут на простых питательных средах . Такие среды готовят, прибавляя к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и другие вещества, необходимые для размножения того или иного микроорганизма. Сложными П. с. являются и дифференциально-диагностические среды, например среды Гисса с углеводами и индикатором, применяемые для определения видовой принадлежности исследуемого микроба по его ферментативной активности. Некоторые сложные среды, так называемые селективные, или элективные, используют для целенаправленного выделения одного или нескольких видов микроорганизмов путем создания оптимальных условий их выращивания и угнетения роста сопутствующей микрофлоры. Например, висмут-сульфитный агар — строго селективная среда для выделения сальмонелл, агар и среда Левина — слабоселективные среды для выделения энтеробактерий.

    В зависимости от состава исходных компонентов различают также среды синтетические, полусинтетические и природного происхождения. Синтетические среды, составные части которых точно известны, и несколько в меньшей степени полусинтетические удобны и используются главным образом для изучения физиологических процессов микроорганизмов. Применение сред такого типа позволяет определить минимальные потребности отдельных микроорганизмов в питательных веществах и, исходя из этого, создать питательные среды , содержащие лишь те соединения, которые необходимы для роста данного микроба. Преимуществом синтетических питательных сред является также их стандартность, однако использование этих сред ограничено из-за высокой стоимости и сложности состава многих из них (нередко они содержат до 40 и более ингредиентов). К тому же они более чувствительны к нарушениям баланса между некоторыми компонентами П. с. , особенно аминокислотами, и размножение микроорганизмов на таких средах легче подавляется избыточной аэрацией или токсическими катионами.

    В микробиологической практике продолжают широко использовать среды природного происхождения, химический состав которых известен недостаточно. Основу таких сред изготавливают из различного сырья животного или растительного происхождения: мяса и его заменителей, рыбы, крови животных, казеина, дрожжей, картофеля, сои и др. Вид и качество этого сырья по существу во многом предопределяют питательную ценность и стандартность применяемых основ и в значительной мере самих сред.

    Наряду с белковыми основами питательные среды должны содержать зольные элементы (фосфор, серу, кальций, магний, железо) и микроэлементы (бор, молибден, кобальт, марганец, цинк, никель, медь, хлор, натрий, кремний и др.). Эти вещества необходимы для многих биосинтетических процессов у бактерий, однако потребность в них у разных видов микроорганизмов неодинакова. Так, например, марганец и железо требуются для кишечной палочки и возбудителей чумы, а калий — для молочнокислых бактерий. Марганец, кальций, магний, калий и железо стимулируют рост сибиреязвенной палочки, а магний, железо и марганец — рост бруцелл.

    Для культивирования многих патогенных микроорганизмов необходимо наличие в среде так называемых факторов роста, представленных прежде всего водорастворимыми витаминами. Хотя бактерии не используют эти вещества как пластический или энергетический материал, тем не менее они являются обязательными компонентами питательных сред, т.к. их отсутствие тормозит образование многих ферментов. Факторами роста могут быть также некоторые органические кислоты, пуриновые и пиримидиновые основания и аминокислоты. Отдельные аминокислоты (L-цистин, D—пироглутаминовая кислота и др.) способны стимулировать рост одних микроорганизмов и, наоборот, угнетать рост других.

    Питательные среды должны содержать все необходимые для выращиваемых микроорганизмов химические элементы в легко усвояемой форме и оптимальных количествах. Источником углерода в П. с. обычно служат отдельные углеводы, соли органических кислот, а также углерод, входящий в состав азотсодержащих соединений (белков, пептонов, аминокислот и др.). Потребности в азоте удовлетворяются при наличии в средах нативного животного белка (кровь, сыворотка, асцитическая жидкость и т.п.), пептонов, аминокислот, солей аммония и других азотсодержащих веществ (пуриновые и пиримидиновые основания, мочевина и др.). В питательные среды вносят минеральные соли, необходимые для микроорганизмов. Микроэлементы, требующиеся бактериям в ничтожно малых количествах, обычно попадают в питательные среды либо с водой, которая используется для приготовления среды, либо с сырьем, входящим в состав П. с. Факторы роста поступают в среду с различными диализатами, экстрактами и аутолизатами в виде аминокислот, пептидов, пуриновых и пиримидиновых оснований и витаминов.

    Белоксодержащее сырье, используемое для приготовления питательных сред , подвергается гидролизу с помощью различных ферментов (пепсина, трипсина, панкреатина, папаина, грибковых протеаз и т.п.) или кислот (реже щелочей). Целью гидролиза является растворение и расщепление протеина с образованием азотистых соединений, усвояемых микробной клеткой: пептонов, полипептидов, аминокислот, которые входят в состав получаемых таким путем гидролизатов. Для удовлетворения питательных потребностей каждого конкретного вида микроорганизмов используют те или иные гидролизаты в зависимости от их химического состава либо в состав П. с. одновременно вводят несколько гидролизатов в отработанных соотношениях.

    Конструируемая П. с. по своему составу и физико-химическим свойствам должна соответствовать условиям естественного обитания микроорганизмов. Различия их питательных потребностей столь многообразны, что исключают возможность создания универсальной П. с. Поэтому современные принципы разработки сред основываются на всестороннем изучении питательных потребностей микроорганизмов.

    Необходимо, чтобы питательные среды не только содержали нужные микробам питательные вещества, но и имели оптимальную концентрацию водородных и гидроксильных ионов. Большинство патогенных микроорганизмов лучше растут на питательных средах со слабощелочной реакцией (рН 7,2—7,4). Исключением являются холерный вибрион, оптимум роста которого находится в щелочной зоне (рН 8,5—9,0), и возбудитель туберкулеза, нуждающийся в слабокислой реакции (рН 6,2—6,8). Для предотвращения изменения рН в процессе культивирования микроорганизмов в П. с. добавляют фосфатные буферы — смесь одно- и двузамещенного фосфатов калия, концентрация которых в среде не должна превышать 0,5%.

    Питательные среды должны иметь достаточную влажность и быть изотоничными для микробной клетки, что обеспечивает нормальное течение в ней важнейших физико-химических процессов. Для большинства микроорганизмов оптимальной является среда, соответствующая 0,5% раствору натрия хлорида. Одним из существенных требований, предъявляемых к питательным средам , служит их стерильность, позволяющая выращивать чистые культуры микробов.

    Важная роль в получении П. с. надлежащего качества принадлежит методам их контроля. Для применяемых в производстве питательных сред главным показателем качества служит эффективность (урожайность) сред, т.е. способность накопления максимального количества биомассы полноценных по свойствам микроорганизмов или продуктов их биосинтеза (токсинов и др.). В оценке диагностических питательных сред ведущим критерием является показатель чувствительности — способность обеспечить рост микроорганизмов в максимальных разведениях культуры возбудителя. В зависимости от назначения питательные среды при оценке их качества используют также и другие показатели — стабильность основных свойств выращиваемых микроорганизмов и скорость их роста, выраженность дифференцирующих свойств и т.п.

    При решении вопросов качества питательных сред немаловажное значение придается их стандартизации, чему способствует изготовление сред в виде сухих препаратов. В СССР налажен промышленный выпуск сухих сред разного назначения: простых, селективных, дифференциально-диагностических и специальных.

    Библиогр.: Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии, М., 1950, библиогр.; Лабораторные методы исследования в клинике, под ред. В.В. Меньшикова, с. 315, 343, М., 1987; Мейнелл Дж. и Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология, пер. с англ., с. 46, М., 1967; Микробиологические методы исследования при инфекционных заболеваниях, под ред. Г.Я. Синая и О.Г. Биргера, с. 64, М., 1949; Энтеробактерии, под ред. В.И. Покровского, с. 258, М., 1985.

Внимание!    Статья ‘Питательные среды‘ приведена исключительно в ознакомительных целях и не должна применяться для самолечения

6 месяцев ago

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *