МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ И БИОХИМИЧЕСКИХ
СВОЙСТВ
Культивирование, то есть выращивание микроорганизмов в лаборатории, применяется для изучения их свойств и для получения биомассы. Бактерии, грибы, актиномицеты, спирохеты и некоторые простейшие культивируются на питательных средах. Хламидии, риккетсии, вирусы и некоторые простейшие способны размножаться только в организме животного или в живых клетках.
Культуральные свойства данного вида микроорганизмов — это: 1) условия, необходимые для размножения, и 2) характер роста на питательных средах. Культуральные свойства — это одна из характеристик, которые учитываются при идентификации (определения вида) микроорганизмов.
Питательные среды
Питательные среды должны соответствовать определенным требованиям. Они должны содержать все питательные вещества, необходимые для размножения данного вида микробов. Одни патогенные микроорганизмы растут на простых питательных средах, другие для своего размножения нуждаются в добавлении крови, сыворотки крови, витаминов.
В питательных средах должны быть созданы определенные условия путем добавления хлорида натрия или буферных растворов. Для большинства бактерий благоприятной является питательная среда, содержащая 0,5% хлорида натрия. Реакция питательной среды, благоприятная для большей части патогенных бактерий — слабощелочная, что соответствует рН=7,2-7,4. Холерный вибрион растет при рН=7,8-8,5, грибы — при рН=5-5,5. Питательные среды должны быть влажными, то есть содержать достаточное количество воды, быть по возможности прозрачными и стерильными, то есть до посева не содержать микробов.
По составу и происхождению питательные среды бывают естественные, искусственные и синтетические. Естественные питательные среды — это натуральный продукт, например, картофель, другие овощи. Искусственные питательные среды готовят по определенной прописи из продуктов с добавлением органических и неорганических соединений. Синтетические среды содержат определенные химические соединения в известных концентрациях.
По консистенции питательные среды бывают жидкие, полужидкие, плотные. В качестве уплотнителя обычно применяют агар-агар -полисахарид, выделенный из морских водорослей. Агар-агар не используется микроорганизмами в качестве питательного вещества, образует в воде гель, плавящийся при 100°С и застывающий при 45°С.
Для получения плотной питательной среды агар-агар добавляют в концентрации 1,5-2%, для полужидкой — 0,5%.
По целевому назначению питательные среды могут быть разделены на обычные (простые), специальные, элективные, дифференциально-диагностические.
Обычные (простые) питательные среды применяют для культивирования большинства микроорганизмов, это мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА).
Специальные питательные среды применяют для культивирования микроорганизмов, которые не растут на простых средах. Например, кровяной агар и сахарный бульон для стрептококка, сывороточный агар для менингококка и гонококка.
Элективные питательные среды используют для выделения одного какого-либо вида из смеси различных бактерий. Данный вид бактерий растет на этой среде быстрее и лучше других, опережая их в своем росте; рост других бактерий задерживается на этой среде. Например, свернутая сыворотка для палочки дифтерии, щелочная пептонная вода для холерного вибриона, желчный бульон для палочки брюшного тифа, солевые среды для стафилококка.
Дифференциально-диагностические питательные среды применяются для отличия одних видов бактерий от других по их ферментативной активности (см. соответствующий раздел).
Культивирование и выделение чистых культур аэробных бактерий
Для культивирования микроорганизмов необходимы определенные условия: температура, аэробные или анаэробные условия.
Температура должна быть оптимальной для данного вида. Большинство патогенных бактерий размножаются при 37°С. Однако для некоторых видов оптимальной является более низкая температура, что связано с особенностями их экологии. Так, для палочки чумы, естественным местом обитания которой являются грызуны в период зимней спячки, оптимум температуры составляет 28°С, как и для лептоспир, для палочки ботулизма — 28°С-35°С.
Кроме оптимальной температуры, для культивирования микроорганизмов, в зависимости от вида, необходима аэробность или анаэ-робность среды.
Для того, чтобы изучить морфологию, Культуральные, биохимические и другие свойства микробов, необходимо получить чистую культуру. Обычно культурой микробов называют скопление их на питательной среде в виде помутнения, придонного (пристеночного) роста или пленки на поверхности жидкой среды или колоний на плотной среде. Отдельная колония образуется из одной микробной клетки. Чистая культура — это культура микробов одного вида, полученная из одной колонии. В лабораториях для различных исследований применяют определенные известные штаммы микробов. Штамм — это чистая культура микробов, полученная из определенного источника, в определенное время, обладающая известными свойствами. Как правило, штаммы микробов обозначают определенным номером. Например, штамм Staphylococcus aureus 209P применяется для определения активности пенициллина.
Выделение чистых культур аэробов занимает, как правило, три дня и производится по следующей схеме:
1-й день — микроскопия мазка из исследуемого материала, окрашенного (обычно по Граму) — для предварительного ознакомления с микрофлорой, что может быть полезным в выборе питательной среды для посева. Затем посев материала на поверхность застывшего питательного агара для получения изолированных колоний. Рассев можно произвести по методу Дригальского на три чашки Петри с питательной средой. Каплю материала наносят на первую чашку и распределяют шпателем по всей чашке. Затем этим же шпателем распределяют оставшуюся на нем культуру на второй чашке и таким же образом — на третьей. Наибольшее количество колоний вырастет на первой чашке, наименьшее — на третьей. В зависимости от того, сколько было микробных клеток в исследуемом материале, на одной из чашек вырастут изолированные колонии.
Такого же результата можно достигнуть, произведя рассев на одной чашке. Для этого делят чашку на четыре сектора. Исследуемый материал засевают бактериологической петлей штрихами на первом секторе, затем, прокалив и остудив петлю, распределяют посев из первого сектора во второй и таким же образом последовательно в третий и четвертый сектор. Из отдельных микробных клеток после суточного инкубирования в термостате образуются изолированные колонии.
2-й день — изучение колоний, выросших на чашках, описание их. Колонии могут быть прозрачными, полупрозрачными или непрозрачными, они имеют различные размеры, округлые правильные или неправильные очертания, выпуклую или плоскую форму, гладкую или шероховатую поверхность, ровные или волнистые, изрезанные края. Они могут быть бесцветными или иметь белый, золотистый, красный, желтый цвет. На основании изучения этих характеристик выросшие колонии разделяются на группы. Затем из исследуемой группы отбирают изолированную колонию, готовят мазок для микроскопического исследования с целью проверки однородности микробов в колонии. Из этой же колонии производят посев в пробирку со скошенным питательным агаром.
3-й день — проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре путем микроскопии мазка. При однородности исследуемых бактерий выделение чистой культуры можно считать законченным.
Для идентификации выделенных бактерий изучаются культураль-ные признаки, то есть характер роста на жидких и плотных питательных средах. Например, стрептококки на сахарном бульоне образуют придонный и пристеночный осадок, на кровяном агаре — мелкие, точечные колонии; холерный вибрион образует пленку на поверхности щелочной пептонной воды, а на щелочном агаре — прозрачные колонии; палочка чумы на питательном агаре образует колонии в виде «кружевных платочков» с плотным центром и тонкими волнистыми краями, а в жидкой питательной среде — пленку на поверхности, а затем -нити, отходящие от нее в виде «сталактитов».
Культивирование и выделение чистых культур анаэробных бактерий
Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, создать анаэробиоз путем удаления кислорода физическими, химическими или биологическими методами.
К физическим методам можно отнести:
1) механическое удаление воздуха с помощью насоса из анаэ-ростата, в котором помещают чашки с посевами. Одновременно можно заменить воздух индифферентным газом: азотом, водородом, углекислым газом.
2) выращивание в среде, содержащей редуцирующие вещества. Среда Китта-Тароцци — это сахарный бульон с кусочками печени или мяса. Глюкоза и кусочки органов обладают редуцирующей способностью. Среду заливают сверху слоем вазелинового масла, чтобы преградить доступ кислорода воздуха.
3) Наиболее простой, но менее надежный способ — выращивание в глубине высокого столбика сахарного агара.
Химические методы заключаются в том, что чашки с посевами анаэробов ставят в герметически закрытый эксикатор, куда помещают химические вещества, например, пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода.
Биологический метод основан на одновременном выращивании анаэробов и аэробов на плотных питательных средах в чашках Петри, герметически закрытых после посева. Вначале кислород поглощается растущими аэробами, а затем начинается рост анаэробов.
Выделение чистой культуры анаэробов начинают с накопления анаэробных бактерий путем посева на среду Китта-Тароцци. В дальнейшем получают изолированные колонии одним из двух способов:
1) посев материала производят путем смешивания с расплавленным теплым сахарным агаром в стеклянных трубках. После застывания агара в глубине его вырастают изолированные колонии, которые извлекают путем распила трубки и пересевают на среду Китта-Тароцци (способ Вейнберга);
2) посев материала производят на чашки с питательной средой и инкубируют в анаэростате. Выросшие на чашке изолированные колонии пересевают на среду Китта-Тароцци (способ Цейсслера).
Культивирование других микроорганизмов
Культивирование микоплазм
Микоплазмы культивируются на питательных средах с добавлением сыворотки и углеводов. Поскольку микоплазмы лишены клеточной стенки, они растут только в изотонических или гипертонических средах. На плотных питательных средах в течение нескольких суток образуются очень мелкие колонии, напоминающие яичницу-глазунью — с выпуклым центром и плоской полупрозрачной периферией. Микоплазмы можно выращивать также на курином эмбрионе или культуре клеток.
Культивирование риккетсий и хламидий
Риккетсии и хламидий — облигатные внутриклеточные паразиты. Для их культивирования используют культуры клеток, куриный эмбрион и заражение животных.
Культивирование грибов
Для культивирования грибов применяют плотные и жидкие питательные среды: чаще всего среду Сабуро, а также среды, содержащие пивное сусло. Грибы растут медленнее, чем бактерии, они образуют видимый рост в течение нескольких суток. Температура культивирования ниже, чем у бактерий — 22-30°С.
Культивирование спирохет и простейших
Среди спирохет наиболее легко выращивать лептоспиры, питательной средой для которых может служить вода с примесью сыворотки крови кролика. Боррелии и трепонемы культивируют в анаэробных условиях на более сложных питательных средах, содержащих сыворотку, кусочки тканей животных.
Среди простейших культивируются на питательных средах дизентерийная амеба, лямблии, трихомонады, лейшмании, трипаносомы, балантидии.Токсоплазмы культивируют в куриных эмбрионах и культурах тканей. Методы культивирования малярийных плазмодиев разрабатываются.
Методы изучения ферментативной активности (биохимических свойств)
В микробиологической практике изучение ферментативной активности используют для идентификации микроорганизмов, поскольку каждый микробный вид обладает определенным набором ферментов.
Для определения протеолитической активности микробы засевают уколом в столбик желатина и после 3-5 суток инкубирования при комнатной температуре отмечают характер разжижения желатина: в виде воронки, гвоздя, чулка или в виде опрокинутой елки. Протеолитическую активность определяют также по образованию продуктов разложения белка: индола, сероводорода, аммиака. Для их определения засевают микроорганизмы в мясо-пептонный бульон, и между горлышком пробирки и ватной пробкой помещают индикаторные бумажки, исключая их контакт со средой. При образовании индола бумага, пропитанная насыщенным раствором щавелевой кислоты, приобретает розовый цвет; в присутствии сероводорода бумага, пропитанная ацетатом свинца, чернеет; при образовании аммиака красная лакмусовая бумажка синеет.
Для определения сахаролитических свойств микробов применяют дифференциально-диагностические среды такие, как среды Гисса, среда Олькеницкого, среда Эндо, среда Левина, среда Плоскирева.
Среды Эндо, Левина, Плоскирева в чашках Петри применяются для дифференцировки бактерий кишечной группы по их способности сбраживать лактозу. Эти среды содержат питательный агар, лактозу и индикатор, изменяющий свой цвет в кислой среде — индикатор рН. Если посеять на такую среду бактерии, которые сбраживают лактозу, например кишечную палочку, то в результате сбраживания лактозы образуется кислота, и индикатор изменит свой цвет в кислой среде. Поэтому колонии кишечной палочки на таких средах будут окрашенными соответственно цвету индикатора: на среде Эндо и среде Плоскирева — в красный цвет, на среде Левина — в черно-синий. Колонии бактерий, не сбраживающих лактозу, таких как сальмонеллы и палочки дизентерии, будут бесцветными.
Среды Гисса (среды «пестрого ряда») готовятся на основе пептон-ной воды или полужидкого мясо-пептонного агара. Содержат какой-либо один углевод или многоатомный спирт и индикатор. При росте на среде Гисса микроба, сбраживающего данный субстрат с образованием кислоты и газа, среда изменит цвет, в полужидкой среде появятся пузырьки и разрывы в толще агара, в жидкой среде — пузырек газа в стеклянном поплавке. При сбраживании субстрата только до кислоты происходит лишь изменение цвета среды.
Применяются также комбинированные среды, содержащие не один углевод, а два или три, например, среда Олькеницкого. Одна пробирка этой среды заменяет скошенный агар и среды Гисса с лактозой, глюкозой и сахарозой. После стерилизации в расплавленном виде среду в пробирке скашивают так, чтобы получился столбик и скошенная часть. Посев производится штрихом по скошенной части и уколом в столбик. При сбраживании лактозы или сахарозы изменяется цвет всей среды, при сбраживании одной глюкозы изменяется цвет только столбика. Образование газа определяется по наличию пузырьков в столбике агара. При выделении микробами аммиака цвет среды не меняется. Образование сероводорода проявляется почернением в столоике агара
Для экспресс-метода определения ферментативной активности бактерий применяются микротестсистемы и система индикаторная бумажная (СИБ)
Микротестсистема представляет собой контейнер из прозрачного полистирола, состоящий из нескольких ячеек Ячейки содержат высушенные питательные среды с углеводами и индикаторами рН В каждую ячейку засевают взвесь культуры бактерий определенной густоты В контрольные ячейки наливают физ раствор Результат учитывают после 3 — 4-хчасовой инкубации в термостате по изменению цвета
индикатора
Системы индикаторные бумажные (СИБ) для идентификации семейства энтеробактерий представляет собой диски или полоски хроматографической бумаги, покрытые защитной пленкой и содержащие определенный субстрат и индикатор В пробирки с физиологическим или буферным раствором вносят исследуемую культуру, затем помещают диски В контрольные пробирки культуру бактерий не вносят Результат учитывают по изменению цвета индикатора Для определения сероводорода диск помещают на поверхность МПА, засеянного уколом, что позволяет одновременно определить подвижность
Во всех пробирках учитывают предварительный результат в тот же день и окончательный — на следующий день
Оксидазная активность определяется путем растирания культуры на индикаторной бумажке Результат учитывается через минуту.
ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ И КЛЕТОК РАСТЕНИЙ
Выращивание изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получило название метода культуры изолированных тканей.
В связи с тем что в жизни человека наибольшее значение имеют семенные растения, методы и условия для их культивирования разработаны лучше, чем для голосеменных растений или водорослей, выращивание которых в стерильных условиях вызывает определенные затруднения. Однако независимо от принадлежности растений к той или иной таксономической группе существуют общие требования к выращиванию объектов в культуре in vitro.
Асептика. Прежде всего культивирование фрагментов ткани или органа растения — эксплантов, а тем более отдельных клеток требует соблюдения полной асептики. Микроорганизмы, которые могут попасть в питательную среду, выделяют токсины, ингибирую- щие рост клеток и приводящие культуру к гибели. Поэтому при всех манипуляциях с клетками и тканями при культивировании in vitro соблюдают определенные правила асептики в ламинар- боксе или в асептических комнатах. В первом случае асептика достигается подачей профильтрованного стерильного воздуха, направленного из ламинкар-бокса наружу, на работающего. Асептические комнаты стерилизуют с помощью ультрафиолетовых ламп, а работают в таких помещениях в стерильной одежде. Рабочую поверхность столов в асептических комнатах и инструменты перед работой дополнительно стерилизуют спиртом.
Чистую посуду, предварительно завернутую в бумагу или в фольгу, инструменты, бумагу, вату стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при температуре 160 °С в течение 1,5 —2 ч. Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С и повышенном давлении в течение 15 — 20 мин. Если в состав питательных сред входят вещества, разрушающиеся при автоклавировании, их следует стерилизовать путем фильтрации через бактериальный фильтр. Затем стерильные профильтрованные компоненты добавляют в проавтоклавированную среду, охлажденную до температуры 40 °С.
Растительные ткани сами по себе могут служить серьезным источником заражения, так как на их поверхности всегда находится эпи- фитная микрофлора. Поэтому необходима поверхностная стерилизация, которую проводят следующим образом. Предварительно часть растения, из которой будет извлечен эксплант, промывают водой с мылом и споласкивают чистой водой. Затем растительный материал стерилизуют в растворах дезинфицирующих веществ. Некоторые из этих веществ, а также время стерилизации представлены в табл. 6.1.
|
Таблица 6.1 Стерилизация исходного растительного материала (по Р. Г. Бутенко, 1999) Объект |
Время стерилизации, мин |
||
|
диацид 0,1 %-й |
сулема 0,1 %-я |
перекись водорода, 10—12 %-я |
|
|
Семена сухие |
15-20 |
10-15 |
12-15 |
|
Семена набухшие |
6-10 |
6-8 |
6-8 |
|
Ткани стебля |
20-40 |
20-25 |
— |
|
Листья |
1-3 |
0,5-3 |
‘ 3-5 |
|
Апексы |
1-10 |
0,5-7 |
2-7 |
После выдерживания эксплантов в дезинфицирующем растворе их несколько раз промывают в дистиллированной воде и скальпелем удаляют наружный слой клеток на срезах эксплантов, так как он может быть поврежден при стерилизации.
Микроорганизмы могут находиться и внутри растительной ткани. Наиболее часто внутреннее инфицирование встречается у тропических и субтропических растений. Поэтому кроме поверхностной стерилизации иногда приходится применять антибиотики, которые и убивают микробную флору внутри ткани. Следует, однако, заметить, что подобная обработка не всегда приводит к стерилизации внутренних тканей, так как трудно выбрать направленно действующий антибиотик.
Питательные среды. Изолированные клетки и ткани культивируют на многокомпонентных питательных средах. Они могут существенно различаться по своему составу, однако, в состав всех сред обязательно входят необходимые растениям макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, фитогормоны и их синтетические аналоги. Углеводы (обычно это сахароза или глюкоза) входят в состав любой питательной смеси в концентрации 2 — 3%. Они необходимы в качестве питательного компонента, так как большинство каллусных тканей лишено хлорофилла и не способно к автотрофному питанию. Поэтому их выращивают в условиях рассеянного освещения или в темноте. Исключение составляет кал- лусная ткань мандрагоры, амаранта и некоторых других растений.
Обязательными компонентами питательных сред должны быть ^ ауксины, вызывающие дедифференцировку клеток экспланта, и ци- токинины, индуцирующие клеточные деления. При изменении соотношения между этими фитогормонами или при добавлении других фитогормонов могут быть вызваны разные типы морфогенеза.
Высокое содержание нитратов, ионов аммония, калия, фосфата способствует быстрому росту клеток. Истощение среды значительно снижает рост и процессы вторичного метаболизма. Однако изначально низкое содержание фосфатов в питательной среде способно стимулировать синтез вторичных метаболитов. Установлено, что культивирование каллусов солодки голой на среде с половинной концентрацией азота и фосфора в темноте увеличивает содержание фенольных соединений в 1,6 раза по сравнению с каллусами, растущими на полной среде. В среду могут быть добавлены эндоспермы незрелых зародышей (кокосовый орех, конский каштан и др.), пасока некоторых деревьев, различные экстракты (солодовый, дрожжевой, томатный сок). Введение их в сре-. ду дает интересные результаты, но такие эксперименты трудно воспроизводимы, так как действующий компонент, как правило, точно неизвестен. Например, добавление в питательную среду отдельных фракций кокосового молока не давало никаких результатов, в то время как нефракционированный эндосперм вызывал деление клеток.
При приготовлении твердых питательных сред для поверхностного выращивания каллусных тканей используют очищенный агар-агар — полисахарид, получаемый из морских водорослей. В качестве примеров в табл. 6.2 приведены составы наиболее распространенных питательных сред.
Среда Мурасиге и Скуга — самая универсальная. Она пригодна для образования каллусов, поддержания неорганизованного кал-, лусного роста, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений. Так, изменение соотношения ауксина и кинетина при- водит к образованию либо корней (преобладание ауксина), либо; стеблевых культур (преобладание кинетина).
Среда Гамборга и Эвелега хорошо подходит для культивирования клеток и тканей бобовых растений и злаков, среда Уайта обес-* печивает укоренение побегов и нормальный рост стебля после регенерации, а среда Нича и Нич пригодна для индукции андро-i генеза в культуре пыльников.
Физические факторы. На рост и развитие растительных тканей; in vitro большое влияние оказывают физические факторы — свет,; температура, аэрация, влажность. |
Свет. Большинство каллусных тканей могут расти в условия^ слабого освещения или в темноте, так как они не способны фото*; синтезировать. Вместе с тем свет может выступать как факторУ обеспечивающий морфогенез и активирующий процессы вторично
|
!Состав питательных сред, применяемых при культивировании клеток и тканей (по Р. Г. Бутенко, 1999) |
Концентрация питательных сред, мг/л |
|||
|
Компонент сред |
Мурасиге и |
Гамборга и |
Уайта, |
Нича и Нич, |
|
Скуга, 1962 |
Эвелега, 1968 |
1939 |
1974-1975 |
|
|
KN03 |
1900 |
3000 |
81 |
950 |
|
NH4NO3 |
1650 |
— |
— |
720 |
|
Ca(N03)2 |
— |
— |
142 |
— |
|
Ca(N03)2-4H20 |
— |
— |
— |
— |
|
(NH4)2S04 |
— |
134 |
— |
— |
|
MgS04-7H20 |
370 |
500 |
74 |
185 |
|
CaCl2H20 |
— |
— |
166 |
|
|
CaClr2H20 |
440 |
150 |
— |
— |
|
KC1 |
— |
65 |
— |
|
|
KH2P04 |
170 |
— |
12 |
68 |
|
NaH2P04H20 |
— |
150 |
— |
— |
|
MnS04H20 |
— |
10 |
— |
— |
|
MnS0„-4H20 |
22,3 |
— |
— |
25 |
|
ZnS04-4H20 |
8,6 |
— |
— |
— |
|
ZnS04-7H20 |
— |
2 |
— |
10 |
|
H3B04 |
6,2 |
3 |
— |
10 |
|
CuS04-5H20 |
0,025 |
0,075 |
— |
0,025 |
|
Na2Mo04-2H20 |
0,25 |
0,25 |
— |
0,25 |
|
CoCl2-6H20 |
0,025 |
— |
— |
— |
|
FeS04-7H20 |
27,8 |
— |
— |
27,8 |
|
Na EDTA-2H20 |
37,3 |
— |
— |
37,3 |
|
Секвестрен 330-Fe |
28 |
— |
— |
|
|
Мезоинозит |
100 |
— |
— |
200 |
|
Аскорбиновая кислота |
— |
— |
— |
3 |
|
Тиамин-HCl |
0,5 |
— |
— |
3 |
|
Пиридоксин-HCl |
0,5 |
— |
— |
1 |
|
Никотиновая кислота |
0,5 |
— |
— |
— |
|
Сахароза |
30 000 |
20000 |
2000 |
60 000 |
|
Агар «Дифко», гель- |
— |
— |
— |
7000 |
|
рит, агароза |
||||
го синтеза. В качестве источника света используют люминесцентные лампы. Для большинства травянистых растений оптимум освещенности составляет примерно 1000 люкс. Слишком низкая (300 люкс) или высокая (3000—10 000 люкс) освещенность подавляет рост. Освещение может влиять на метаболизм каллусных клеток. Так, в культурах чайного растения под действием света увеличивался биосинтез полифенолов. Напротив, в культуре клеток Scopolia parvi- flora свет подавлял образование алкалоидов. Кроме интенсивности освещенности на культуру ткани и ее физиологические особенности влияет качество света. Так, более 20 флавонов и флавоноловьп гликозидов образуется в культурах клеток петрушки после освещения ее непрерывным люминесцентным светом «холодный белый» Вместе с тем синтез флавоновых гликозидов активируется при последовательном облучении ультрафиолетовым светом, а затем светом, лежащим в области «красный—длинноволновый красный*
Температура. Для большинства каллусных культур оптимальна температура 26 °С. В то же время каллусы и культуры клеток диос кореи дельтовидной хорошо растут даже при температуре 32 °С. В отличие от роста культур клеток и тканей индукция их морфогенеза требует более низких температур (18 — 20 °С). Влияние температуры на метаболизм клеток in vitro изучено слабо. Есть данные, что в каллусных культурах максимальное образование алкалоидов наблюдалось при температуре 25 °С, а при повышении температуры резко снижалось. В суспензионных культурах клеток Ipomoea содержание жирных кислот значительно увеличивалось, если их выращивали при субоптимальных температурах роста (15 °С) Поэтому при выращивании культуры in vitro необходимо тщательно изучать влияние всех абиотических факторов, в том числе температурного, на рост и метаболизм клеток.
Аэрация. Для выращивания суспензионных культур большое значение имеет аэрация. Особенно важно снабжение воздухом культивируемых клеток в больших объемах ферментеров.
При сравнении разных типов ферментеров было показано, что синтез вторичных метаболитов в суспензионной культуре был наибольшим при подаче воздуха снизу. При выращивании клеток в малых объемах (в колбах) нормальная аэрация достигается при постоянном перемешивании суспензии.
Влажность. Оптимальная влажность в помещении, где расту!, культуры, должна составлять 60 — 70%.
Таким образом, культивирование клеток и тканей зависит от многих факторов внешней среды, и действие их не всегда хорошо изве? стно. Поэтому при введении в культуру нового вида растений необ-т ходимо прежде всего тщательно изучить влияние физических фак торов на рост и физиологические характеристики этой культуры.
Выращивание изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получило название метода культуры изолированных тканей.
В связи с тем, что в жизни человека наибольшее значение имеют семенные растения, методы и условия для их культивирования разработаны лучше, чем для голосеменных растений или водорослей, выращивание которых в стерильных условиях вызывает определенные затруднения. Однако, независимо от принадлежности растений к той или иной таксономической группе, существуют общие требования к выращиванию объектов в культуре in vitro.
Асептика. Прежде всего, культивирование фрагментов ткани или органа растения — эксплантов, а тем более отдельных клеток требует соблюдения полной асептики. Микроорганизмы, которые могут попасть в питательную среду, выделяют токсины, ингибирующие рост клеток и приводящие культуру к гибели, поэтому при всех манипуляциях с клетками и тканями при культивировании in vitro соблюдают определенные правила асептики.
Питательные среды. Изолированные клетки и ткани культивируют на многокомпонентных питательных средах. Они могут существенно различаться по своему составу, однако, в состав всех сред обязательно входят необходимые растениям макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, фитогормоны и их синтетические аналоги. Углеводы (обычно это сахароза или глюкоза) входят в состав любой питательной смеси в концентрации 2—3%. Они необходимы в качестве питательного компонента, так как большинство каллусных тканей лишено хлорофилла и не способно к автотрофному питанию. Поэтому их выращивают в условиях рассеянного освещения или в темноте. Обязательными компонентами питательных сред должны быть ауксины, вызывающие дедифференцировку клеток экспланта, и цитокинины, индуцирующие клеточные деления. При изменении соотношения между этими фитогормонами или при добавлении других фитогормонов могут быть вызваны разные типы морфогенеза.
Физические факторы. На рост и развитие растительных тканей in vitro большое влияние оказывают физические факторы — свет, температура, аэрация, влажность. Большинство каллусных тканей могут расти в условиях слабого освещения или в темноте, так как они не способны фотосинтезировать. Вместе с тем свет может выступать как фактор, обеспечивающий морфогенез и активирующий процессы вторичного синтеза. Для большинства каллусных культур оптимальна температура 26 °С. Для выращивания суспензионных культур большое значение имеет аэрация. Особенно важно снабжение воздухом культивируемых клеток в больших объемах ферментеров. Оптимальная влажность в помещении, где растут культуры, должна составлять 60—70%. Таким образом, культивирование клеток и тканей зависит от многих факторов внешней среды, и действие их не всегда хорошо известно. Поэтому при введении в культуру нового вида растений необходимо прежде всего тщательно изучить влияние физических факторов на рост и физиологические характеристики этой культуры.
Дата добавления: 2016-06-02; просмотров: 493;
ПОСМОТРЕТЬ ЕЩЕ:
Процесс выращивания клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) называется методом получения культуры изолированных тканей. Культура изолированных тканей обычно представлена каллусными и гораздо реже опухолевыми тканями (рис. 3.1. и 3.2).
Культуры изолированных клеток и тканей.
Использование культуры изолированных клеток и тканей.
Культуры изолированных тканей широко используются в сельском хозяйстве и промышленном производстве. Они обладают преимуществами по сравнению с традиционным растительным сырьем (дикорастущими и выращиваемыми на плантациях растениями), а именно:
1. Независимостью от внешних условий.
2. Оптимизацией условий выращивания.
3. Автоматизацией и компьютеризацией процессов.
4. Возможностью выращивать исчезающие виды растений.
5. Возможностью массового клонального микроразмножения плодоовощных и декоративных растений.
6. Оздоровлением от вирусных и других инфекций.
7. Возможностью, с помощью культуры in vitro, расширения направлений селекционной работы, то есть — получить клоны клеток, затем и растения с запрограммированными свойствами.
Благодаря способности клеток синтезировать в культуре вторичные метаболиты, возникла новая отрасль промышленности, осуществляющая биологический синтез веществ, необходимых человеку.
Условия культивирования тканей и клеток.
Культивирование фрагментов ткани или одного растения — эксплантов, а тем более отдельных клеток, требует соблюдения полной асептики.
Микроорганизмы, которые могут попасть в питательную среду, выделяют токсины, тормозящие рост клеток и приводящие культуру к гибели. Поэтому все манипуляции с клетками и тканями при культивировании in vitro проводят с соблюдением определенных правил асептики в ламинар-боксе или в асептических комнатах. Асептика достигается подачей пропущенного через фильтры стерильного воздуха, направленного из ламинар-бокса наружу. На поверхности растительных тканей всегда находится эпифитная микрофлора. Поэтому необходима поверхностная стерилизация, которая достигается путем обработки участков растений, из которых будут выделять экспланты, дезинфицирующими веществами (перекись водорода, сулема).
Для работы с биологическим материалом необходимы следующие составляющие:
— чистая посуда и биореактор (ферментёр);
— стерильная питательная среда;
— оптимальное освещение;
— оптимальная температура;
— оптимальная влажность;
— аэрация.
Чистая посуда и ферментёр. Предварительно завернутые в бумагу или фольгу инструменты и вату стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при температуре 160оС в течение 1,5-2 часов.
При использовании разных типов ферментеров было установлено, что физиологические свойства культур могут меняться, поэтому синтез вторичных метаболитов в суспензионной культуре следует проводить при подаче воздуха снизу. В этих условиях синтез протекает намного активнее (рис. 3.3).
При выращивании клеток в малых объемах, например, в колбах, нормальная аэрация достигается при постоянном перемешивании суспензии.
Питательные среды. Культивирование изолированных клеток и тканей происходит в многокомпонентных питательных средах. Они могут существенно различаться по своему составу, однако в состав всех сред обязательно входит и компонентная основа, к которой добавляют необходимые растениям группы веществ: макро- и микроэлементы, углеводы, витамины и фитогормоны. Такой компонентной основой служит агар-агар – полисахарид морских водорослей, способный образовывать в воде гели, затвердевающие при 45°С. В питательную среду могут быть добавлены эндоспермы незрелых зародышей (кокосового ореха, конского каштана), патока некоторых деревьев, различные экстракты (солодовый, дрожжевой), томатный сок. Введение их в среду дает положительный результат. Однако каждый действующий компонент имеет свойственные только ему технологические характеристики.
Рис. 3.3. Биореактор (ферментер) для выращивания микроорганизмов, клеток или тканей
Дедифференцировка – основа процесса образования каллуса.
Дедифференцировка– это возвращение специализированных клетокв меристематическое состояние, когда они получают способность к делению.
Органы и ткани растений служат исходным материалом для получения культур клеток и тканей, однако, чаще для этого используют листья растений.
Предварительно отработанный стерильный фрагмент листа помещают на твердую питательную среду. Листья состоят из разных тканей, клетки которых дифференцированы и синтезируют различные, характерные для этих клеток молекулы белков, углеводов, липидов и др. веществ. Данные дифференцированные клетки не обладают способностью к делению.
В процессе механическом повреждении листа происходит выделения экспланта, а под действием добавленных в среду растительных гормонов ауксинов и цитокининов клетка дедифференцируется. Она теряет запасные вещества – крахмал, белки, липиды, специализированные органеллы хлоропласты и др. В результате этого все клетки приобретают новые близкие морфологические и физиологические свойства, т.е. становятся каллусными (делящимися) клетками. На листовом экспланте формируется каллусная ткань.
Типы клеточных культур. В зависимости от способа и условий культивирования существуют несколько типов культур клеток и тканей:
— каллусная культура;
— суспензионная культура;
— культура одиночных клеток.
Если культивирование происходит поверхностно на агаризованной питательной среде, то образуется каллусная ткань. Она не имеет четкой структуры, но может различаться по плотности. Происхождение и условия выращивания определяют, будет ли каллусная ткань рыхлой, средней плотности или плотной.
Общие характеристики каллусных клеток. Каллусная клетка обладает целым рядом свойств, общих со всеми растительными клетками. Это онтогенез клеток, устойчивость к тем или иным неблагоприятным факторам внешней среды и другие свойства. Вместе с тем, у каллусных клеток во время их культивирования появляются свои индивидуальные особенности, такие как физиологическая асинхронность, генетическая гетерогенность и некоторые другие.
Физиологическая асинхронность заключается в том, что в каждый момент времени клетки находятся в разных фазах роста: одни делятся, другие растут, а третьи уже стареют. Поэтому общее физиологическое старение всей популяции каллусных клеток принято оценивать по состоянию большинства клеток (рис. 3.4).
Рис. 3.4. Каллусные клетки вРис. 3.5. Выход протопласта через
Дата добавления: 2016-05-28; просмотров: 1915;
